WWW.KNIGA.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Онлайн материалы
 

Pages:   || 2 |

«ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕРИЛЛИЯ, КАДМИЯ, РТУТИ, СВИНЦА И ТАЛЛИЯ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ МЕТОДОМ ЗЕЕМАНОВСКОЙ МОДУЛЯЦИОННОЙ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«Санкт-Петербургский государственный университет»

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ

Николай Дмитриевич

ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕРИЛЛИЯ, КАДМИЯ,

РТУТИ, СВИНЦА И ТАЛЛИЯ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ МЕТОДОМ

ЗЕЕМАНОВСКОЙ МОДУЛЯЦИОННОЙ ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ

СПЕКТРОМЕТРИИ

специальность 02.00.02 — аналитическая химия Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель доктор физико-математических наук, профессор Ганеев Александр Ахатович Санкт-Петербург Содержание ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БЕРИЛЛИЯ, КАДМИЯ, РТУТИ, СВИНЦА И

ТАЛЛИЯ

1.1.1 Бериллий

1.1.2 Кадмий

1.1.3 Ртуть

1.1.4 Свинец

1.1.5 Таллий

1.2 ОСНОВНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО

АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

1.2.1 Выбор метода анализа для проведения прямого определения микроэлементов в цельной крови

1.2.2 Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

1.2.3 Атомно-абсорбционная спектрометрия с электротермическим способом атомизации



1.2.3.1 Методы инструментальной коррекции неселективного поглощения в ААС

1.2.3.2 Химическая модификация в ААС-ЭТА

1.2.3.3 Определение ртути с использованием техники «холодного пара»..... 41 ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ I

ГЛАВА II. ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА АНАЛИТИЧЕСКОГО МЕТОДА

И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА АНАЛИТИЧЕСКОГО МЕТОДА.................. 43

2.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.2.1 Аппаратура

2.2.1.1 Атомно-абсорбционный спектрометр МГА-915 с высокочастотной Зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией фона.................. 46 2.2.1.2 Источники электромагнитного излучения

2.2.1.3 Графитовый атомизатор Массмана

2.2.1.4 Ртутно-гидридная приставка РГП-915

2.2.1.5 Анализатор ртути РА-915+

2.2.2 Анализируемые образцы

2.2.3 Реактивы и материалы

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕРИЛЛИЯ В КРОВИ

3.2 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАДМИЯ И СВИНЦА В КРОВИ.................. 64

3.3 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАЛЛИЯ В КРОВИ

3.4 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РТУТИ В КРОВИ

3.4.1 Непосредственный ввод пробы крови в атомизатор

3.4.2 Отгонка элементной ртути в атомизатор с применением РГП............... 97 3.2.2.1. Выбор оптимальных условий проведения реакции восстановления и отгонки ртути в атомизатор

3.2.2.2. Выбор оптимальных условий осаждения и удерживания ртути в атомизаторе

3.5 ПРОВЕРКА ПРАВИЛЬНОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК.......... 114

ГЛАВА IV. ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК

ПРЯМОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕРИЛЛИЯ, КАДМИЯ, СВИНЦА,

ТАЛЛИЯ И РТУТИ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени в организме человека обнаружено до 80 химических элементов [1-3]. При этом все они в той или иной степени участвуют в процессах жизнедеятельности. Некоторые металлы (в частности, Be, Cd, Hg, Pb, Tl) чрезвычайно токсичны для живых организмов [4].





В доиндустриальный период развития общества значительная нагрузка на биосферу токсичными химическими элементами была характерна в основном для эндемических районов. В настоящее время, в связи с всё возрастающим антропогенным загрязнением, большая часть населения Земли, так или иначе, подвергается воздействию токсичных металлов [5].

Они поступают в организм человека с пищей, водой и вдыхаемым воздухом.

Наибольшую угрозу здоровью токсичные элементы создают для сотрудников производств с вредными условиями труда и населения, проживающего в непосредственной близости от таких предприятий. Таким образом, любого жителя крупного промышленного центра можно отнести к потенциальной группе риска.

Для оценки вредного воздействия на организм человека недостаточно только контроля загрязнения окружающей среды. Необходим непосредственный контроль содержания токсиканта в организме, поскольку диагноз острого или хронического отравления считается окончательным и достоверным только при определении концентрации токсического вещества (или его метаболита) в биосредах пострадавших [6]. При оценке экологической нагрузки на организм соединениями металлов, диагностике профессиональных заболеваний и нарушений метаболизма, связанных с токсическим воздействием соединений металлов, проведения химикотоксикологической экспертизы для установления факта отравления необходимы данные по микроэлементному анализу биосубстратов. Наиболее информативными биосубстратами живого человека являются биологические жидкости, такие как цельная кровь, моча, сыворотка и плазма крови [4].

Существует большое число аналитических методов, позволяющих успешно решать задачу определения микроэлементов в биологических средах человека. Однако трудности анализа, связанные со сложным матричным составом и негомогенностью биопроб, приходится решать за счет сложной предварительной процедуры подготовки проб к анализу. В первую очередь, это минерализация биологического материала. Операция пробоподготовки определяет не только экспрессность элементоопределений, но также, в значительной степени, правильность результатов и чувствительность анализа [7,8]. Как положительные, так и отрицательные систематические погрешности на стадии разложения могут быть значительными. Первые возникают за счет внесения загрязнения из применяемых реактивов, посуды и материалов; вторые связаны с потерями аналитов за счет образования летучих соединений, осаждения и соосаждения малорастворимых компонентов, разбрызгивания и сорбции на стенках сосудов, неполноты разложения образца.

По сравнению с определением микроэлементов после предварительного разложения проб прямой микроэлементный анализ биологических объектов, то есть определение аналитов без предварительной деструкции матрицы, операций разделения и концентрирования аналитов, имеет ряд преимуществ – сокращение времени анализа, исключение возможных систематических погрешностей стадии минерализации проб, снижение пределов обнаружения.

Экспрессность анализа, характерная для методик прямого определения, важна не только при срочной диагностике острых отравлений, но и при потоковых анализах, так как позволяет снизить себестоимость единичного элементоопределения за счет сокращения времени анализа, расходов на реактивы, химическую посуду и материалы.

В данной работе разработан и реализован методический подход к микроэлементному анализу биологических жидкостей, основанный на прямом определении Be, Cd, Hg, Tl в цельной крови человека с помощью Зеемановской модуляционной поляризационной спектрометрии (ЗМПС) с электротермической атомизацией пробы в графитовой печи.

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В настоящей главе кратко рассмотрена биологическая функция бериллия, кадмия, ртути, свинца и таллия в организме человека. Проведен обзор аналитических методов, которые используются в настоящее время для определения микроэлементов в биологических жидкостях. Основное внимание уделено современным методам клинического микроэлементного анализа – масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС) и атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией (ААС-ЭТА). Также рассмотрены методические приемы, которые позволяют исключить сложную процедуру предварительной подготовки проб биологических жидкостей для микроэлементного анализа.

1.1 БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БЕРИЛЛИЯ, КАДМИЯ, РТУТИ, СВИНЦА

И ТАЛЛИЯ

Функционирование биологических систем требует участия микроэлементов, причем воздействие различных микроэлементов на процессы жизнедеятельности выражается весьма разнообразно [4]. С точки зрения элементного состава, живые организмы можно рассматривать как сложную динамическую полиэлементную систему [9, 10]. В зависимости от содержания в организме химические элементы обычно делят на три группы [11]:

Макроэлементы. К ним относятся O, H, C, N, P, S, Ca, K, Na, Cl, Mg, содержание каждого из которых в организме превышает 10 -2 %.

Некоторые элементы этой группы (O, H, С, N, P, S) называют «органогенами» в связи с их определяющей ролью в формировании структуры тканей и органов.

Микроэлементы. В эту группу входят: Fe, Zn, F, Sr, Mo, Cu, Br, Si, Cs, J, Mn, Al, Pb, Cd, B, Rb, их содержание составляет от 10-6 % до 10-2%.

Ультрамикроэлементы, содержание которых менее 10-6% – Se, Co, V, Cr, As, Ni, Li, Ba, Ti, Ag, Sn, Be, Ga, Ge, Hg, Sc, Zr, Bi, Sb, U, Th, Rh.

Недостатком данной классификации является то, что в ней не отражена биологическая роль химических элементов. На основе биологической роли в организме элементы, составляющие массу клеток и тканей, можно разделить на структурные элементы (органогены и макроэлементы), эссенциальные (жизненно необходимые), условно эссенциальные, потенциально токсичные и токсичные микроэлементы [4,9,11].

Несмотря на бесспорную полезность указанных классификаций очевидна их условность, поскольку количественное содержание и биологическая роль некоторых микро и ультрамикроэлементов может значительно изменяться в зависимости от среды обитания, рациона питания, характера профессиональной деятельности человека. Эссенциальные элементы при превышении порога оптимального поступления проявляют токсические свойства, а токсичные элементы могут быть полезными и даже необходимыми для организма [12].

Для осуществления жизненно важных функций каждого элемента существует оптимальный диапазон его концентраций в различных средах и органах организма. Уровни содержания элементов в человеческом организме адекватно отражают результаты анализа таких биологических жидкостей, как кровь, моча, плазма и сыворотка крови [13]. Биологические жидкости человека характеризуются рядом определенных показателей, в том числе и концентрацией ряда химических элементов. Эти показатели различаются для людей разного пола и возраста, однако должны находиться в некоторых физиологических пределах – отвечать условной норме. В настоящее время в справочной литературе и публикациях для обозначения условной нормы содержания микроэлемента применяют такие термины как нормальное содержание, фоновое содержание, среднее содержание, референтные пределы, биологически допустимый уровень [14]. Для концентраций элемента представляющих угрозу здоровья обычно используют термины критический уровень или токсическое содержание.

Как уже было упомянуто выше, бериллий, кадмий, ртуть, свинец и таллий относят к токсичным микроэлементам [15]. Для всех этих элементов не найдено жизненно важных функций. Контроль содержания ртути, свинца и кадмия важен как для оценки профессионального воздействия, так и при проведении любого экологического мониторинга из-за их широкого использования в самых разных отраслях промышленности [5, 16]. Контроль уровня бериллия в организме необходим у персонала, контактирующего с данным металлом и его соединениями (в первую очередь атомная, авиакосмическая, металлургическая промышленность) [17]. Задача определения концентрации таллия в биосубстратах, в первую очередь, возникает в химико-токсикологической экспертизе и клинической диагностике при подозрении на отравление его соединениями, а также для контроля лечения [18].

1.1.1 Бериллий Бериллий обладает поливалентным воздействием на организм человека: общетоксическим, аллергическим, иммунотоксическим, канцерогенным и мутагенным [17,19]. Ионы бериллия специфически ингибируют активность щелочной фосфатазы, угнетающе действуют на другие ферменты [20,21]. В местах внутримышечного введения бериллия происходит разрушение окружающих тканей. Различают острые и хронические отравления бериллием [13].

Проявлениями воздействия бериллия является бериллиоз (хроническая бериллиевая болезнь): поражение легочной ткани (фиброз, саркоидоз);

поражение кожи (экземы, дерматоз); поражение опорно-двигательного аппарата [22,23]; эрозии слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта;

нарушения функций миокарда, печени [24]; развитие аутоиммунных процессов, опухолей [4]. Коварство бериллия, его способность вызывать реакцию сенситизации требуют строгого контроля состояния здоровья всех людей, работающих с этим металлом и его соединениями [17,25].

Бериллий принимает участие в регуляции фосфорно-кальциевого обмена. Установлено, что даже небольшое количество бериллия в составе костей приводит к их размягчению. Бериллий ослабляет и разрушает костную ткань, систематически «отнимая» фосфаты у гидроксиапатита остеоцитов и нарушая минеральный обмен в целом [26,27]. Известно, что введение этого элемента животным вызывает «бериллиевый» рахит [11].

Заболевание, возникающее в результате длительно воздействия бериллия, представляет собой гранулематозный процесс, проявляющийся преимущественно в легких, реже в других органах [28,29]. В отличие от острого поражения, интенсивность хронического воздействия, по-видимому, не является важным фактором, определяющим тяжесть поражения. Дело в том, что в основе патологии лежит реакция гиперчувствительности к бериллию, выступающему в качестве антигена или гаптена [22,23]. Скрытый период между моментом первого воздействия бериллия и развитием клинических проявлений заболевания может продолжаться от нескольких месяцев до 30 лет. Средняя продолжительность латентного периода составляет 6-10 лет [25].

При исследовании биоптатов легких, пораженных хронической бериллиевой болезнью, выявляются нераспадающиеся гранулемы, мононуклеарные клеточные инфильтраты в интерстиции легких и фиброз легких различной степени выраженности. В бронхоальвеолярном лаваже обнаруживается большое количество лейкоцитов, увеличенное число лимфоцитов, повышенное соотношение Т-хелперов к Т-супрессорам [30,31].

Помимо легких, гранулемы обнаруживаются в печени, селезенке, региональных лимфатических узлах, миокарде, скелетных мышцах, почках, слюнных железах, костях, коже [17,25]. Показано, что степень воздействия бериллия зависит от химической формы его поступления в организм [32].

Повышенный уровень бериллия встречается у людей, контактирующих с этим элементом на производстве в авиакосмической, ядерной, военной, автомобильной, электронной, телекоммуникационной промышленности, в приборостроении, при производстве люминесцентных ламп. Для предупреждения развития патологии, вызываемой контактом с соединениями бериллия на производстве, необходимо строго соблюдать правила техники безопасности (использование респираторов, сменной одежды и т.д.), устранять действие на организм возможных раздражителей (никотин, переохлаждения, аллергены). При возникновении хронической интоксикации необходима смена места работы [17,33].

Среднесуточное поступление бериллия в организм человека составляет 10-20 мкг. Основные пути поступления пероральный и ингаляционный [33].

При поступлении с пищей в растворимой форме в желудочно-кишечный тракт бериллий взаимодействует с фосфатами и образует плохо растворимый Be3(PO4)2 или связывается белками эпителиальных клеток в прочные протеинаты. Поэтому всасываемость бериллия в ЖКТ невелика и колеблется от 4 до 10 % от поступившего количества [11]. Установлено, что бериллий накапливается в легких, печени, лимфатических узлах, костях, миокарде.

Выводится бериллий из организма чрезвычайно медленно, преимущественно с мочой (свыше 90%) [11]. Установлено, что выведение бериллия из организма (особенно из органов лимфатической системы) происходит чрезвычайно медленно в течение более 10 лет.

Индикаторами экспозиции и интоксикации являются содержание бериллия в моче, биоптатах костной и легочной также, а также крови, сыворотке и плазме крови. Различают фоновую концентрацию бериллия в крови (менее 1 мкг/л) и токсическую концентрацию (более 20 мкг/л) [4].

Данные по фоновому содержания бериллия в крови достаточно противоречивы от 0,07 мкг/л до 0,60 мкг/л [34], то есть при отсутсвии контакта с данным металлом бериллий обнаруживается даже такими высокочувствительными методами как ИСП-МС только на уровне пределов определения. С другой стороны, промышленное воздействие бериллия представляет угрозу для организма человека, поэтому необходимы экспрессные методики контроля токсических и субтоксических концентраций бериллия в биосредах промышленно занятого персонала и населения, проживающего на загрязненных территориях.

1.1.2 Кадмий Одним из опасных для здоровья микроэлементов является кадмий.

Некоторые источники даже называют кадмий "наиболее опасным экотоксикантом на рубеже тысячелетий" [35-37].

Кадмий обладает гонадотропным, мутагенным, канцерогенным, эмбриотропным действием, способствует возникновению почечной дисфункции. При хроническом кадмиозе, в первую очередь, поражается мочевыводящая и половая системы [4]. Наблюдается протеинурия, гликозурия, аминоацидоурия, 2-микроглобулинурия [38], простатопатия с риском возникновения новообразований и геморрагического некроза яичек [39-41]. Роль кадмия также доказана в развитии рака легких и рака почек у курящих [42]. Нарушение в работе выделительной системы способствует развитию гипертонического синдрома [43]. Поражение бронхолегочной системы сопровождается фиброзными изменениями и повышением риска возникновения эмфиземы. Развивается анемия, связанная со снижением всасывания железа в кишечнике и лизисом эритроцитов. Установлено, что кадмий тормозит превращение 25-гидроксихолекальциферола в 1,25дигидрохолекальциферол [44], подавляет экспрессию и ингибирует активность лизилоксидазы в межклеточном матриксе [45]. В результате нарушения всасывания кальция и эндокринных расстройств отмечаются остеопатические и остеопорозные изменения костной ткани [46].

Общетоксическое действие кадмия обусловлено его химическим сходством с цинком, приводящем к нарушению функций множество цинксодержащих протеинов.

При остром пищевом отравлении кадмием наблюдаются признаки острого гастроэнтерита – рвота, боли и судороги [9]. Гораздо опаснее отравление кадмием при вдыхании его паров или кадмий содержащей пыли (как правило, производственная экспозиция) [42]. Симптомами такого отравления являются отек легких, головная боль, тошнота или рвота, озноб, слабость и диарея. В результате таких отравлений были зафиксированы смертельные случаи [25].

Классическим примером хронического отравления кадмием является заболевание, впервые описанное в Японии в 50-е годы ХХ века [47] и получившее название болезнь "итай-итай" [48-50]. Заболевание сопровождалось сильными болями в поясничной области, миалгией, а также остеомаляцией (размягчением костей). Помимо нарушений в опорнодвигательном аппарате присутствовали и характерные признаки поражения почек, носившего необратимый характер [51]. Были зафиксированы сотни смертельных исходов "итай-итай". Столь массовый характер это заболевание приняло в силу высокого уровня загрязнения окружающей среды кадмием, а также специфики питания населения [50]. Основа рациона японцев – рис и морепродукты способны накапливать кадмий в высоких концентрациях. В дальнейшем, в результате мероприятий по охране окружающей среды, частота и острота синдромов, подобных "итай-итай" заметно снизилась.

Промышленное использование кадмия и соответственно загрязнение им почвы, воды и воздуха неуклонно возрастает. Кадмий находит широкое применение в ядерной энергетике для изготовления стержней атомных реакторов, в гальванотехнике в качестве антикоррозийных и декоративных покрытий, производстве аккумуляторов (никель-кадмиевые батареи), используется как стабилизатор поливинилхлорида, пигмент в стекле и пластмассах, электродный материал, компонент различных сплавов [4,42].

Основными источниками загрязнения окружающей среды этим элементом являются: производство цветных металлов, сжигание твердых отходов, угля, сточные воды горнометаллургических комбинатов, производство минеральных удобрений, красителей [42].

Антропогенная эмиссия кадмия в биосферу превышает природную в несколько раз. Например, в воздушную среду ежегодно поступает до 12800 тонн кадмия, причем более 85% — в результате деятельности человека [42].

Кадмий легко аккумулируется многими организмами, в особенности бактериями и моллюсками. В пресноводной среде кадмий в основном поглощается за счет абсорбции непосредственно из воды, в то же время морские организмы, напротив, поглощают кадмий из пищи [52].

Естественными источниками поступления кадмия в организм служат пища (90-95)%, вода (5-10%) и воздух (примерно 1%). По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) суммарное суточное поступление кадмия в организм человека из всех источников составляет 10-50 мкг [42].

Основным и наиболее прогнозируемым источником кадмия является пища – в среднем от 10 до 30-40 мкг кадмия в сутки. Как уже было отмечено выше, отдельные продукты питания (злаковые культуры, грибы, морепродукты, печень и особенно почки животных) имеют выраженную способность накапливать данный тяжелый металл [53,54]. Кроме того, недостаток в пище железа и кальция может привести к 2-3 кратному повышению усвояемости кадмия из желудочно-кишечного тракта [4,55].

По данным ВОЗ суточное потребление кадмия с водой, как правило, не превышает 2-5 мкг, хотя и может в отдельных регионах достигать 20 мкг.

Поступление кадмия с дыханием для населения, проживающего в незагрязненных районах, не превышает 0,1 – 0,8 мкг в сутки, а для проживающих в окрестностях предприятий, служащих источником кадмиевого загрязнения, – до 2-10 мкг в сутки. Существенно больше кадмия получают курящие люди. Человек, выкуривающий в день пачку сигарет, подвергает свой организм дополнительному воздействию не менее 20 мкг кадмия в день [42]. По данным [56] уровень кадмия в легких курильщиков в 7,5 раз превышают уровень для некурящих. Поскольку адсорбция кадмия через легкие значительно выше чем в желудочно-кишечном тракте (в зависимости от степени растворимости в воде ингалированных соединений всасывается от 10-20% до 90%, абсорбция в ЖКТ составляет в среднем 4то курильщик как минимум в 1,5-2 раза увеличивает нагрузку кадмием на свой организм [42].

Основным депо кадмия в организме служат почки (30-60% всего количества) и печень (20-25%). [36]. Остальной кадмий находится в поджелудочной железе, селезенке, трубчатых костях, других органах и тканях. Основной механизм детоксикации кадмия в организме – образованием комплекса со специальным белком металлотионеином, однако большая доля кадмия остается в более токсичной ионной форме [57].

Поступивший в кровь кадмий связывается эритроцитами и альбуминами плазмы. Связавшийся с плазмой металл быстро переходит в различные ткани и органы, преимущественно печень и почки (до 50%). Как и многие другие тяжелые металлы, кадмий имеет отчетливую тенденцию к накоплению в организме – период его полувыведения составляет 10-35 лет. [25,36].

Приоритетными индикаторами экспозиции кадмия являются его уровни в моче, цельной крови и волосах. Данные разных источников по содержанию кадмия в крови разноречивы и колеблются в пределах: 0,3-2; 3мкг/дм3. Токсические содержания 100-300 мкг/дм3 [58-61]. Высокая токсичность и экологическая опасность кадмия требует наличия методик контроля его фоновых и токсических концентраций в крови человека.

1.1.3 Ртуть Ртуть и ее соединения отличаются высокой токсичностью, широким спектром и разнообразием клинических проявлений в зависимости от свойств веществ, в составе которых металл поступает в организм (пары, неорганические или органические соединения), а также путей поступления [62]. Профессиональную опасность представляют собой неорганические соединения ртути: металлическая ртуть, соли одновалентной, двухвалентной ртути и комплексы, в которых двухвалентная ртуть связана с лигандами, способными замещаться тиоловыми группами. В первую очередь, ионы ртути взаимодействуют с SH-группами белков, карбоксильными и аминогруппами, чем объясняют глубокие нарушения центральной нервной системы (ЦНС), особенно ее высших отделов [14,63].

Как уже было отмечено выше, клинические проявления воздействия ртути зависят от ее химической формы [64] и пути проникновения в организм [9, 65, 66]. Вдыхание паров элементарной ртути приводит к поражению почек, дыхательной и центральной нервной систем. Поражение ЦНС создает целый ряд поведенческих и нейрологических нарушений [67,68].

Поступление неорганических солей ртути через желудочно-кишечный тракт может привести к его серьезным поражениям в силу разъедающего действия. После всасывания неорганическая ртуть концентрируется в почках и может вызвать необратимые некротические изменения их тканей [4].

В общем случае, органические формы ртути, такие как метилртуть, более токсичны для человека [65]. Эти формы ртути способны преодолевать плацентарный барьер и, являясь сильными тератогенами, вызывать поражения плод, приводя к послеродовому церебральному параличу. Дети чрезвычайно уязвимы для ртути, как при перинатальном, так и постнатальном воздействии [63,69]. Органические формы ртути появляются в пищевых цепях в результате биометилирования неорганических солей ртути бактериями [70]. Попадая в окружающую среду, различные формы ртути подвергаются многократным взаимопревращениям за счет окислительно-восстановительных процессов, а также метилированиядемитилирования с участием живых организмов, вливаясь в глобальный «цикл ртути» [71,72].

Хроническое отравление ртутью развивается постепенно и проявляется в виде признаков микромеркуриализма и меркуриализма.

Микромеркуриализм проявляется совокупностью симптомов в виде снижения работоспособности, быстрой утомляемости, ослабления памяти, головных болей; возможны катаральные явления на слизистой дыхательных путей и ротовой полости. Меркуриализм (выраженная стадия) отравления ртутью, характеризуется симптомами ртутной неврастении: ртутным тремором (дрожание рук, век, языка, в тяжелых случаях ног и всего тела) [63], ртутным эретизмом. Первые признаки интоксикации – повышенная утомляемость, слабость, сонливость, апатия, эмоциональная неустойчивость, головные боли и головокружения. Характерны кровоточивость десен, гингивиты, стоматиты, гиперсаливация [73]. Также происходят поражения периферической нервной системы в виде болей в конечностях и расстройства чувствительности.

Пары ртути и аэрозоли ее соединений практически полностью задерживаются в дыхательных путях [9,66], согласно [72] абсорбция ртути в легких превышает 80%. Максимальное накопление ртути отмечается в костном мозге, костях, селезенке, печени, почках. Выведение ртути из организма происходит всеми возможными путями, в первую очередь, почками [74], а также желудочно-кишечным трактом, легкими, потовыми, молочными и слюнными железами. Выделение ртути осуществляется очень медленно, через 2 недели после введения ртутного препарата остается еще 1/3 дозы.

[2] Период полувыведения ртути состоит из нескольких фаз:

быстрой фазы, которая начинается через несколько часов после отравления и длительной фазы, которая может продолжаться до года [70].

В производственных условиях основное значение имеет поступление ртути через дыхательные пути в виде паров и аэрозолей [75]. А для людей, производственно не связанных с ртутью, основным источником ртути является потребление в пищу морских организмов, в первую очередь, хищных рыб [76,77]. Заболевание, вызванное потреблением рыбы и морепродуктов, загрязненных ртутью, получило названием болезнь Минамата [78,79]. Как и болезнь «итай-итай» данное заболевание было распространено в Японии в 1950-х годах и, в конечном итоге, было обусловлено антропогенным загрязнением окружающей среды. Снижения уровня промышленного загрязнения прибрежных вод привело к снижению случаев Минамата.

Рекомендуемые биосреды для оценки экспозиции ртутью и ее неорганическими соединениями – кровь и моча [4,13]. Максимально допустимая концентрация ртути в моче у лиц, имеющих профессиональный контакт, но практически здоровых – на уровне 50 мкг/г креатинина и 20 мкг/л крови. Эти уровни можно рассматривать как тест экспозиции для лиц, имеющих профессиональный контакт, но практически здоровых. Верхний предел допустимого содержания в крови лиц, не имеющих профессионального контакта, составляет 15 мкг/л [80,81]. Определение фоновых и токсических концентраций в крови человека – один из наиболее часто используемых диагностических тестов при проведении биомониторинга токсичных металлов, поэтому необходимы достаточно простые, чувствительные и экспрессные методики определения.

1.1.4 Свинец Свинец и его соединения нарушают процессы костномозгового кроветворения, что проявляется в виде анемий как за счет подавления синтеза гема, так и сокращения среднего времени жизни эритроцитов [82].

Действие свинца на кроветворение связано с его вмешательством в ферментативные процессы, обеспечивающие синтез гема [83], включение железа в протопорфирин [84] и метаболизм железа в целом [85]. Свинец активно влияет на синтез белка, энергетический баланс клетки, ее генетический аппарат. Отмечается сходство в проявлении токсического действия большинства неорганических соединений свинца [4]. Как и в случае кадмия и ртути, токсичность свинца отчасти обуславливается его способностью индуцировать окислительный стресс [86].

Свинец повреждает сердечнососудистую систему, вызывая развитие гипертонической болезни, вероятно, в силу снижения функции почек [87] и окислительного стресса, приводящего к высвобождению маркеров воспаления [88,89], участие которых доказано в патогенезе сердечнососудистых заболеваний [90]. Свинец также способствует возникновению изменений в миокарде и капиллярах [86]. В центральной нервной системе (ЦНС) свинец вызывает нарушения проводящих путей [91], поражает паренхиматозные и эндокринные органы. Подчеркивается особая опасность воздействия свинца на ЦНС детей [92,93]. Интоксикация свинцом может протекать по типу токсического гепатита, сопровождается повышением активности трансаминаз, нарушением детоксицирующей функции печени, гиперглобулинемией. При интоксикации свинцом страдает желудочно-кишечный тракт, поджелудочная железа, нарушается секреция слюнных желез. Свинец обладает выраженным гонадотоксическим действием, проникает через плацентарный барьер, оказывает эмбриотоксическое и тератогенное действие [13].

Основной путь поступления свинца в организм (около 70%) лежит через желудочно-кишечный тракт [94], причем абсорбция в нем выше для детей, чем для взрослых [86]. Степень всасывания зависит от растворимости соединений. В условиях производства поступление в организм в основном происходит через органы дыхания; поступление в желудочно-кишечный тракт возможно при нарушении санитарных правил (при загрязнении пищи и воды). Интенсивность поступления свинца в организм человека составляет 10-20 мкг/день, а порог токсичности равен 1 мг/день [9].

Свинец и его неорганические соединения характеризуются выраженными кумулятивными свойствами: свыше 90% поступившего в организм свинца задерживается в скелете, причем депонированный свинец может вымываться в кровь [86], вызывая рецидивы интоксикации. Помимо скелета значительные количества свинца накапливаются в зубах и волосах человека. Выведение свинца из организма происходит в основном со стулом (80-90%), меньшая часть – с мочой. Свинец быстро элиминируется из крови, в то время как его выведение из скелета занимает месяцы и годы [95].

Жители промышленных районов и крупных мегаполисов, как правило, испытывают значительную нагрузку свинцом из-за его значительного промышленного использование (производство аккумуляторов, электронная индустрия, сжигание ископаемых топлив и др.), а также в прошлом длительного использования этилированного бензина [96].

В настоящее время в Российской Федерации биомониторинг, как система оценки потенциальной опасности действия токсикантов для здоровья работников, не имеет должного распространения. При множестве регламентированных веществ для воздуха рабочей зоны (более 2500 регламентов) биологические индексы экспозиции установлены далеко не для всех соединений. Свинец является исключением, для него в санитарных правилах, принятых в 1999 году, предписана необходимость оценки его содержания в крови у рабочих, имеющих профессиональный контакт со свинцом, и установлен биологический предел вредного действия [97,98].

Основным, рекомендуемым биологическим субстратом для оценки экспозиции свинцом и его соединениями является кровь. Считается, что определение концентрации свинца в крови дает меньше отклонений, чем содержание свинца в моче и лучше коррелирует с абсорбированной дозой металла. Согласно СП 2.2.5.780-99 (Гигиенические требования при работе со свинцом) в качестве биологически предельно допустимой концентрации (БПДК) для свинца и его неорганических соединений принята концентрация свинца в крови для мужчин – 500 мкг/л, для женщин – 300 мкг/л, регистрируемые на уровне ПДКр.з. равной 0,05 мг/м3 [99]. Вследствие длительного периода полувыведения время проведения анализа не имеет значения.

Геохимические условия и место проживания оказывают влияние на содержание свинца в биосредах. У лиц, не имеющих профессионального контакта со свинцом, в крови может содержаться от менее 50 до 200 мкг/л [58,60]. Биомониторинг свинца в организме человека, наряду с ртутью и кадмием – наиболее часто решаемая задача клинического элементного анализа.

1.1.5 Таллий По степени воздействия на организм человека таллий относится к наиболее токсичным металлам [100]. Токсичность таллия превышает токсичность таких элементов как свинец, кадмий и ртуть [101,102]. Несмотря на то, что случаи острых отравлений таллием встречаются довольно редко, попадание в организм даже небольшого количества этого элемента может нанести серьезный вред здоровью человека. Таллий относят к «приоритетным загрязнителям» антропогенного происхождения [103], поскольку он переходит в биодоступную форму преимущественно в результате деятельности человека [104].

Главным антропогенным источником таллия являются выбросы производственных процессов, таких как: обжиг цинковых, свинцовых и медных сульфидных руд и сжигание каменного угля [104-106]. Раньше соли таллия активно использовали для борьбы с грызунами [107]. Повышенные количества таллия также могут быть обнаружены в трубных газах и пыли, образующихся при производстве цемента, которые в последствие попадают из атмосферы в почву [106].

Основной мишенью для воздействия таллия является центральная нервная система (ЦНС) [108]. Токсичность таллия, в первую очередь, обусловлена способностью к изоморфному замещению ионов калия и натрия в ферментах и протоплазме клеток [109]. Сродство таллия к Na+/K+-АТФазе и, соответственно, скорость проникновения таллия через клеточные мембраны значительно превышает скорость проникновения калия [110,111], происходит значительное изменение мембранных потенциалов, что приводит к выраженным функциональным нарушениям ЦНС [4]. Другим направлением действия таллия является образование прочных комплексов с серосодержащими лигандами, что приводит к нарушению в работе ферментов, содержащих сульфгидрильные группы [104]. И, наконец, показано ингибирующее действие таллия на селенопротеины антиоксидантной защиты (глутатионпероксидаза, тиоредоксинредуктаза), которое, наряду его с взаимодействием с глутатионом [112], приводит к развитию окислительного стресса [113]. Помимо этого, на изолированных митохондриях было показано, что таллий разобщает цепь передачи электронов [114,115].

Клиническая картина при острых и хронических отравлениях таллием и его соединениями отличается значительным разнообразием симптомов и не вполне четкой клинической картиной на ранних стадиях заболевания [116].

Выраженные симптомы могут появляться через несколько суток, что затрудняет раннюю диагностику отравления. Специфическими симптомами являются: обширная аллопеция на 10-14 день после острой интоксикации [104] (таллий вызывают нарушение синтеза кератина в волосяных луковицах), поражение дыхательных путей, зрения, желудочно-кишечного тракта (тошнота, боли в животе) и неврологические расстройства, которые проявляются в спутанности сознания, галлюцинациях и судорогах [9]. При отравлении таллием возможна некорректная первичная диагностика, например: грипп или желудочно-кишечная инфекция, для четкого установления факта отравления таллия обязательна лабораторная диагностика [117].

Среднее поступление таллия в организм человека с пищей и водой составляет 1,6 – 2 мкг/сутки, с вдыхаемым воздухом – 0,05 мкг/сутки. Таллий проникает через неповрежденную кожу, легко всасывается в желудочнокишечном тракте [118], быстро переходит из крови в тканевые клетки и накапливается в почках, печени, селезенке, мышцах и слюнных железах.

Концентрация этого металла в различных органах и тканях человека варьирует в следующих пределах: мозг (0,42-1,5 нг/г) печень (1,5 нг/г) почки (6,1 нг/г) волосы (7 – 650 нг/г) кость (0,6 мкг/г) ногти (1,2 мкг/г) При острых отравлениях максимальная концентрация таллия [11].

обнаруживается в почках, затем в слюнных железах [119], а при постепенном перераспределении таллия его депонирование происходит в костях и волосах [120]. Среднее содержание таллия в таких биологических жидкостях как кровь и моча мало и составляют соответственно 0,05 – 0,5 мкг/л и 0,25 мкг/л [4].

При интоксикации, в зависимости от индивидуальной чувствительности, концентрация таллия в цельной крови составляет 8 – 800 мкг/л, в моче 0,2 мг/л. При летальном исходе 4 мг/л – кровь, 5,2 мг/л – моча [4]. Таллий медленно выводится из организма (до 1 года) через желудочнокишечный тракт, с мочой, желчью и слюной [117]. Как и в случае бериллия, определение таллия в бисоредах человека проводят для профессионального занятого населения и, наиболее часто, для подтверждения факта острого таллиевого отравления, имеющего, как правило, криминальную, реже случайную, природу. Тем не менее, поскольку для таллия характерны низкие уровни токсических концентраций, для его определения в крови нужны надежные и чувствительные методики определения.

1.2 ОСНОВНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО

АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ

В практике микроэлементного анализа биологических жидкостей находят применение практически все спектральные методы элементного анализа с различными вариантами пробоподготовки в зависимости от их чувствительности и селективности: атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС) в различных модификациях, атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС), рентгенофлуоресцентный анализ (РФА) и масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ИСПМС). Реже применяют нейтронно-активационный анализ (НАА) и электрохимические методы анализа, такие как инверсионная вольтамперометрия (ИВА). Для бериллия, кадмия, ртути, свинца и таллия характерны низкие концентрации в крови человека. Поэтому, очевидно, что их определение возможно проводить только с использованием высокочувствительных методов анализа. В таблице 1 приведены данные по фоновым и токсическим уровням этих элементов в крови, представленные в различных литературных источниках. Следует отметить, что для разных источников данные часто значительно отличаются, что может свидетельствовать о несовершенстве существующей на сегодняшний день методической базы микроэлементного анализа биологических жидкостей [121].

–  –  –

Анализ основных публикаций по теме элементного анализа биологических жидкостей показывает, что существует два основных методических подхода к определению микроэлементов: первый – с применением предварительной минерализации проб и второй – прямое определение микроэлементов без разложения биопроб [121]. Наиболее часто используют методический подход, предполагающий предварительную процедуру разложения проб или операции разделения и концентрирования.

Для подготовки проб крови и мочи к определению микроэлементов применяют различные способы разложения: традиционное кислотное разложение с использованием азотной кислоты и пероксида водорода [124ультразвуковую деструкцию матрицы [128,129], ультрафиолетовый фотолиз [130], щелочное разложение, как правило, с гидроксидом тетраметиламмония [131], денатурацию белков трихлоруксусной [132] или азотной кислотой, микроволновую минерализацию [133] [134-140].

Последний метод разложения проб в последние годы занимает лидирующие позиции, поскольку имеет целый ряд преимуществ перед другими способами пробоподготовки. Микроволновая минерализация образцов происходит при высоких температурах и давлениях, развивающихся внутри закрытых сосудов. Поэтому данный способ разложения позволяет минимизировать количество реагентов и, как следствие, возможное загрязнение проб, а также значительно сократить время разложения [141-144]. Разделение и концентрирование в практике микроэлементного анализа биологических объектов, в настоящее время, применяют преимущественно при использовании методов, обладающих недостаточной чувствительностью, например, ААС с атомизацией в пламени [129,135,145,146].

Методология минерализации проб биологических объектов хорошо отработана, однако методикам, предполагающим разложение проб, присущи существенные ограничения. Во-первых, стадия предварительной подготовки пробы является определяющей в плане правильности анализа, то есть.

некорректное проведение этой стадии может сделать бессмысленным использование высокоточных методов, поскольку в этом случае даже самое тщательное измерение аналитического сигнала не даст правильной информации о содержании определяемого элемента. Систематическая погрешность разложения может быть весьма существенной. Она обусловлена загрязнением проб следами элементов, присутствующими в реактивах и на поверхности лабораторной посуды, потерями элементов, связанными с разбрызгиванием пробы, сорбцией аналитов на стенках посуды, их улетучиванием и соосаждением, неполнотой вскрытия пробы [147]. Использование разложения или / и разделения и концентрирования также существенно удлиняет и удорожает анализ в результате увеличения ручного труда аналитика, затрат на реактивы и расходные материалы, электроэнергию и т.п. И, наконец, при использовании разложения проб без последующего концентрирования (относительного или абсолютного), как правило, имеет место снижение чувствительности определений в силу значительных разбавлений, а также, в ряде случаев, существенной поправки холостого опыта.

Более привлекателен анализ биологических жидкостей напрямую, без минерализации проб, что исключает загрязнение, минимизирует потери и сокращает время анализа. С точки зрения токсикологии и клинической лабораторной диагностики, временной фактор может оказаться решающим особенно в случае острых отравлений. Очевидно, что при проведении токсикологического скрининга необходимы экспрессные методики анализа.

Прямые методики также предпочтительны и при биомониторинге, так как позволяют сократить время и стоимость аналитических исследований. При микроэлементном анализе крови использование прямого анализа позволяет работать с малыми объемами капиллярной крови, что важно при обследовании детей [121]. При использовании прямого подхода подготовка пробы, как правило, состоит в разбавлении проб крови в 5-50 раз, сыворотки и мочи в 2-10 раз раствором азотной кислоты с добавлением для стабилизации клеточных мембран и протеинов поверхностно активных веществ, например, Тритона-X-100 [122,148-151].

1.2.1 Методы анализа, используемые для проведения определения микроэлементов в цельной крови Использование прямого подхода к микроэлементному анализу биообъектов создает достаточно строгие ограничения при выборе аналитического метода.

Относительно высокие пределы обнаружения РФА ограничивают применение данного метода в клиническом анализе.

Круг определяемых микроэлементов в биосубстратах для метода РФА несколько расширяется, когда их содержания превышают 0,1 мг/л, однако, в основном ограничивается Zn, Fe, Cu, Se, Pb, Br и Rb [152-156]. Для анализа биопроб предпочтительны спектрометры рентгенофлуоресцентного анализа с полным отражением. В обзоре L.M. Marco P., E.A. Hernandez-Caraballo [153] рассмотрены возможности использования РФА с полным отражением в прямом анализе биологических материалов (сыворотки крови, мочи, цельной крови, тканей мозга в виде суспензии и амниотической жидкости). Авторы сравнивают прямой анализ пробы, высушенной под инфракрасной лампой на поверхности гидрофобизированного кварцевого рефлектора и анализ образца, подвергнутого микроволновому разложению со смесью азотной кислоты и пероксида водорода in situ, то есть также прямо на поверхности рефлектора. Согласно данным [153,156], возможен прямой анализ сыворотки крови на содержание Cu, Fe, Zn, Se (и Pt для пациентов, проходящих химиотерапию ее препаратами [152]). Для определения других элементов, особенно легких (K, Ca, S и др.) в крови, моче, сыворотке крови, спинномозговой и амниотической жидкостях рекомендовано использовать разложение для исключения мешающего влияния Cl, дающего чрезвычайно интенсивный пик Cl K, [153,157]. Но, несмотря на сравнительно большое число работ по анализу биологических жидкостей методом РФА, этому методу закономерно отдается предпочтение при анализе твердых образцов, например, костных тканей [158-160].

Методы инверсионной вольтамперометрии в основном используют для определения Cu, Zn, Co, Pb,Cd, Ni и Cr [125,127,130,161-164]. При этом в последнее время наиболее часто для определения следов элементов в биологических средах применяют адсорбционную вольтамперометрия с катодной разверткой. Этот вариант ИВА заключается в адсорбционном выделении аналитов из разложенных проб в виде комплексов с органическими лигандами с последующим катодным восстановлением комплекса металла. В целом, методики на основе ИВА занимают много времени из-за обязательной пробоподготовки.

Методы ИСП-АЭС и ААС с атомизацией в пламени, несмотря на высокую производительность, также находят ограниченное применение. В силу недостаточной чувствительности их применяют преимущественно для определения элементов, референтые содержания которых высоки, например Zn, Cu, щелочноземельных металлов [165].

1.2.2 Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой В настоящее время в клиническом элементном анализе наиболее часто используют масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой и атомноабсорбционную спектрометрию с электротермическим способом атомизации (ААС-ЭТА), поскольку оба метода обладают достаточными для определения большинства микроэлементов метрологическими характеристиками

Достоинства ИСП-МС известны [5,15,121,166-169]:

[15,121,165].

многоэлементность определения в сочетании с высокой чувствительностью обеспечивают данному методу высокую производительность [170]. Тем не менее, для ряда элементов (прежде всего Se, As, Cd, Cr, Mn и др.) характерны значительные спектральные наложения полиатомных ионов и изобарные наложения других элементов [166,167,171,172]. Спектральные помехи и другие матричные влияния [173]) приводят к изменениям ионизационных характеристик плазмы, засорению конусов и распылительной системы масс-спектрометра и, как следствие, к ухудшению правильности, чувствительности и воспроизводимости измерений.

Требуются дополнительные приемы для устранения или учета этих влияний.

Для учета спектральных интерференций используют ИСП-МС с двойной фокусировкой или ИСП-МС с реакционными ячейками [169,172,174-177], что дополнительно усложняет оптимизацию параметров определения элементов.

Следует отметить, что высокая стоимость основного оборудования и расходных материалов, а также жесткие требования к инфраструктурному оснащению лаборатории (вентиляция, зоны с очищенным воздухом) и к уровню подготовки персонала до сих пор ограничивают применение ИСПМС в клинико-диагностических лабораториях и санитарно-гигиенических организациях [121,170].

Высокая производительность элементоопределений ИСП-МС при анализе сложных негомогенных биологических проб в значительной степени ограничивается необходимостью проведения пробоподготовки, как правило, полной минерализации проб [136,138,148,178-181]. Только отдельные работы в рамках метода ИСП-МС посвящены прямому анализу биологических жидкостей, например, в работе [182] при анализе цельной крови для ввода аналитов в индуктивно связанную плазму авторы использовали лазерную абляцию. Также применяется электротермическое испарение. Использование лазерной абляции или [183,184,185].

электротермического испарителя усложняет процедуру анализа и требует специального технического оснащения спектрометра. Данные по анализу биологических жидкостей методом ИСП-МС после разбавления проб ограничиваются преимущественно анализом разбавленных проб мочи [149Это связано, вероятно, с меньшим содержание органического вещества в моче по сравнению с кровью. Только отдельные публикации посвящены прямому анализу проб крови, как правило, с применением внутренних стандартов и специальных смесей для разбавления проб [122,148,188,189]. В частности, в работе [122] проведен биомониторинг проб крови на содержание 37 элементов (в том числе Be, Cd, Hg, Pb, Tl) методом ИСП-МС с динамической реакционной ячейкой после 1/10 разбавления проб 0,1% Тритоном Х-100 и 0,5% аммиаком с введением внутренних стандартов.

Однако по количеству опубликованных работ методики ИСП-МС без предварительного разложения проб биологических жидкостей значительно уступают работам с использованием минерализации проб. Вероятно, в силу существенных интерфейсных проблем, характерных для ИСП-МС анализа проб с большими концентрациями органического вещества, засорением распылительной системы и интерфейса масс-спектрометра, «эффектом памяти» [170], а также спектральных наложений [176]. Таким образом, существуют ограничения применения ИСП-МС в клиническом анализе, особенно при работе в рамках методического подхода без предварительного разложения проб.

1.2.3 Атомно-абсорбционная спектрометрия с электротермическим способом атомизации Традиционным и более доступным по приборному оснащению методом клинического микроэлементного анализа является ААС-ЭТА.

Атомно-абсорбционная спектрометрия – высокоселективный метод количественного элементного анализа, поскольку число используемых абсорбционных линий не велико, и они обладают очень малой шириной.

Метод позволяет определять около 70 элементов, причем возможно достижение относительно низких пределов обнаружения: в электротермическом варианте – от тысячных до десятых долей мкг/л [190].

Для таких элементов, как As, Cd, Hg, Se, Zn пределы обнаружения, реализуемые в методе с серийно выпускаемой аппаратурой, являются одними из самых лучших в аналитической химии. По воспроизводимости ААС-ЭТА соответствует уровню для количественных определений и соответствует требованиям к точности характерным для клинического анализа. Метод успешно применяется для анализа объектов различной природы, в том числе биоматериала и достаточно широко представлен в аналитических лабораториях.

Как и любой метод анализа, метод ААС имеет свои ограничения.

Наиболее существенным недостатком является необходимость последовательного определения отдельных элементов и необходимость иметь отдельный источник излучения для каждого из них. Существующие в настоящее время атомно-абсорбционные спектрометры с источником непрерывного спектра, несмотря на ряд достоинств, пока не нашли широкого применения в аналитической практике, в первую очередь, по причине их достаточно высокой стоимости по сравнению с традиционными приборами с источниками линейчатого спектра [191,192]. Спектральный диапазон современных серийно выпускаемых спектрометров составляет 190-900 нм, что ограничивает возможность определения ряда элементов, спектры которых не имеют линий поглощения в доступной для наблюдения спектральной области, например инертные газы, галогены, углерод, сера, азот.

ААС дает возможность проводить анализ широкого круга элементов и объектов, обеспечивая правильность и высокую воспроизводимостью в широком диапазоне концентраций. Как и в случае ИСП-МС, реализация метода ААС-ЭТА в микроэлементном анализе биологических жидкостей возможна или в рамках традиционного подхода с разложением проб, или в рамках прямого определения микроэлементов. Следует отметить, что при реализации обоих подходов, в той или иной степени, имеют место матричные влияния и спектральные помехи, ухудшающие качество измерений.

Матричные влияния и помехи (физические, химические, ионизационные и спектральные) заключаются:

в потере элементов даже при невысоких температурах пиролиза в результате образования летучих соединений; улетучивании элементов в неатомизированной форме на фронте подъема температуры;

в образовании трудноатомизируемых соединений с компонентами матрицы и графитовой поверхностью атомизатора, что приводит к значительному изменению температуры атомизации по сравнению с чистыми растворами;

в высоком уровне неселективного поглощения при одновременном поступлении компонентов матрицы и аналита в газовую фазу графитовой печи на стадии атомизации [190,193,194].

Комплекс методических приёмов, позволяющих устранить матричные влияния при элементном анализе проб сложного состава методом ААС-ЭТА, был сформулирован В. Славиным и др. (W. Slavin et al.) в концепции «температурно-стабилизированной печи с платформой» (Stabilized temperature platform furnace – STPF) [195]. Концепция включает положения, большинство из которых давно уже стали традиционными и общепризнанными в ААС-ЭТА анализе. В частности, применение аргона в качестве защитного газа и остановка газовых потоков внутри атомизатора во время регистрации аналитического сигнала, использование печей с пиропокрытием различной геометрии с платформой Львова [196-201], применение химической модификации и проведение количественных измерений по площади пика интегрального сигнала абсорбции аналита.

1.2.3.1 Методы инструментальной коррекции неселективного поглощения в ААС Одним из основных пунктов концепции STPF [195] является использование надежных и эффективных методов коррекции неселективного поглощения. В существующих методах инструментальной коррекции неселективного поглощения аналитический сигнал рассчитывается по разности уменьшения интенсивности аналитического и опорного излучения.

Точность измерения селективной абсорбции тем выше, чем ближе по времени происходит измерение общего и неселективного сигнала. Важным требованием к оптической схеме спектрометра является идентичность величины неселективного поглощения при регистрации аналитического и опорного излучений, которые должны быть спектрально гомологичны, а также гомологичны в пространстве и во времени.

Метод дейтериевой коррекции включает применение дополнительного источника излучения. Для получения аналитического излучения применяется линейчатый источник, удовлетворяющий требованию А. Уолша (А. Walsh) [202], а в качестве опорного излучения используется часть излучения сплошного спектра дейтериевой или вольфрамово галогенной лампы [190], выделенная в спектральной области резонансной линии определяемого элемента. Поскольку ширина регистрируемого спектрального диапазона много больше ширины атомной линии поглощения, поглощение излучения дейтериевой лампы атомами аналита пренебрежимо мало, в то время как величина неселективного поглощения приблизительно одинакова как для опорного, так и для аналитического излучения.

Дейтериевая коррекция находит применение в микроэлементном анализе биологических жидкостей практически исключительно при условии использования предварительных операций разложения или/и разделения и концентрирования, например [140,203]. Недостаточную селективность ААС с дейтериевой коррекцией возникает из-за низкой пространственной и временной гомологичности системы коррекции. Недостаточная пространственная гомологичность возникает из-за технических трудностей создания одинакового распределения интенсивности по площади сечения лучей для неидентичных оптических путей аналитического и опорного излучения [193]. Низкая временная гомологичность дейтериевой коррекции обусловлена различием постоянных времени двух усилительнопреобразовательных трактов спектрометра, а также недостаточно высокой частотой переключения этих трактов. И наконец, метод дейтериевой коррекции позволяет устранить влияние только широкополосного неселективного поглощения. Если же спектр представлен сравнительно узкими молекулярными полосами или линиями поглощения посторонних атомов, то возможна серьезная ошибка в оценке неселективного поглощения.

Таким образом, помимо пространственной и временной негомологичности имеет место также и спектральная негомологичность аналитического и опорного луча [204]. Поэтому для метода ААС с дейтериевой коррекцией необходимо применение химических путей уменьшения интенсивности спектральных влияний [193].

Более эффективными инструментальным методом коррекции неселективного поглощения является применение эффекта Зеемана [205].

Возможно несколько вариантов реализации данного метода коррекции, в первую очередь, использование прямого и обратного эффекта Зеемана [206Коррекция на основе прямого эффекта Зеемана (источник излучения помещен в магнитное поле) имеет ограниченное применение, например в атомно-абсорбционных анализаторах ртути РА-915+ [209]. Наиболее часто применяют инструментальную коррекцию с обратным эффектом Зеемана. В этом случае используется Зеемановское расщепление линий поглощения анализируемых атомов, когда атомизатор помещен в магнитное поле [210].

Принцип коррекции основан на том, что, возникающие вследствие расщепления, Зеемновские - и - компоненты линии поглощения атомов поглощают линейно поляризованное излучение в зависимости от направления его поляризации, а поглощение, характеризующееся широкополосным спектром ослабления излучения, например, рассеяние на частицах дыма, аэрозолях не зависит от поляризации падающего излучения.

Влияния молекулярного поглощения устраняется за счет того, что большинство молекул обладают широкими полосами поглощения, то есть Зеемановское расщепление молекулярных полос поглощения не приводит к образованию дифференциального сигнала. Кроме того, у молекул магнитное расщепление полос проявляется слабо из-за малой величины множителя Ланде [190,193].

В большинстве Зеемановских атомно-абсорбионных спектрометров для формирования аналитического и опорного луча используют модуляцию напряженности магнитного поля при постоянной поляризации падающего излучения. Атомизатор помещают в продольное или поперечное магнитное поле. Если направление силовых магнитных линий совпадает с оптической осью, то при нулевом значении напряженности происходит атомное и неселективное поглощение резонансного излучения, а при наличии поля – только неселективное поглощение, так как - компоненты абсорбционной линии определяемых отсутствуют при данной геометрии, а -компоненты сильно смещены относительно спектрального положения линии испускания.

Таким образом, на частоте модуляции возникает сигнал, связанный только с атомным поглощением. В случае поперечного магнитного поля при рабочем значении напряженности - компоненты абсорбционной линии значительно смещаются относительно спектрального положения линии испускания и не могут участвовать в атомном поглощении [202], а для - компонент происходит резонансное поглощение. Для исключения влияния компонентов линии поглощения применяют дополнительный поляризатор [193].

Для Зеемановской коррекции характерна бльшая гомологичность аналитического и опорного излучения по сравнению с дейтериевой коррекцией, так как при использовании единственного источника излучения пространственная и спектральная гомологичность обеспечивается автоматически.

Тем не менее, для обеспечения временной гомологичности необходимо использовать специальные приемы из-за поочередной регистрации аналитического и опорного излучения. Временную гомологичность сигналов можно улучшить путем повышения частоты коммутации аналитического и опорного сигналов. Однако возможности повышения частоты модуляции аналитического и опорного излучения в Зеемановской спектроскопии с модуляцией магнитного поля сильно ограничены инерционностью магнита, которая не позволяет модулировать напряженность магнитного поля с частотой свыше 100 Гц при её значениях на уровне 0,8 Тл. Поэтому для учета временной негомологичности применяют временные интерполяционные алгоритмы расчета селективного аналитического сигнала, однако их применение не всегда эффективно [193].

Временная негомологичность, присущая методу Зеемановской коррекции с модуляцией магнитного поля, приводит к увеличению случайной ошибки и ухудшению соотношения сигнал/шум с ростом оптической плотности, и, как следствие, к увеличению пределов обнаружения, ухудшению воспроизводимости результатов, а также при высоких значениях абсорбционности, к возникновению неисключенной систематической погрешности.

К сожалению, не удалось обнаружить публикаций, в которых были бы непосредственно указаны предельные значения абсорбционности, при которых еще возможно получить достоверные аналитические сигналы.

Выводы о предельных значениях оптической плотности возможно сделать только по косвенным данным, таким как рабочие значения абсорбционности, используемая пробоподготовка (разложение, разбавление проб) и модификаторы. Как правило, рабочие значения абсорбционности составляют не более 0,5 [192,211-214]. В рамках метода ААС-ЭТА с Зеемановской коррекцией при модуляции магнитного поля при анализе биологических жидкостей преимущественно используют разложение проб [124,126,132].

Как правило, для сложных биологических проб, таких как цельная кровь, характерен не только высокий уровень неселективного поглощения, но и его быстрое нарастание на стадии атомизации пробы. Поэтому для адекватной регистрации аналитического сигнала при анализе таких объектов система коррекция должна обладать высокой временной гомологичностью.

В Зеемановской спектроскопии с модуляцией поляризации резонансного излучения (ЗМПС) повышение частоты коммутации аналитического и опорного излучения не вызывает серьезных технических трудностей. Бльшая временная гомологичность Зеемановской модуляционной поляризационной коррекции по сравнению с коррекцией с модуляцией магнитного поля обеспечивается возможностью повышения частоты модуляции в 500 – 1000 раз. Применение высокочастотной модуляции поляризации электромагнитного излучения (частота модуляции 50 кГц) совместно с постоянным магнитным полем (напряженность 0,60 МА/м) дает выигрыш в эффективности учета фоновой абсорбции по сравнению с традиционной Зеемановской коррекцией [215]. Однако здесь возникает другая проблема. Как известно, для большинства элементов наблюдается аномальный эффект Зеемана. В отличие от Зеемановской спектроскопии с модуляцией магнитного поля, где зависимость дифференциального сечения от индукции магнитного поля в импульсе носит пороговый характер, то есть напряженность поля должна быть выше определенного порогового значения, в ЗМПС эта зависимость для элементов с аномальным типом Зеемановского расщепления носит экстремальный характер. Поэтому, в случае Зеемановской спектроскопии с поляризационной модуляцией необходимо выбирать условия, при которых дифференциальное сечение поглощения излучения и, соответственно, чувствительность анализа будут максимальны [193].

Тем не менее, значительное увеличение частоты модуляции позволяет более эффективно учитывать неселективное поглощение особенно при высоких значениях оптической плотности [215]. Метод ЗМПС с успехом применялся для создания методик прямого определения элементов в объектах со сложным матричным составом [5,216-221]. Однако для окончательного выбора аналитического метода, позволяющего работать при более высоких уровнях неселективного поглощения и минимизировать необходимые предварительные операции с пробой, провели дополнительные экспериментальные исследования (глава II).

Сложности атомно-абсорбционного анализа биологических жидкостей связаны не только с высоким уровнем неселективного поглощения, но и со значительными физико-химическими влияниями матрицы. Например, известно, что одним из основных мешающих неорганических компонентов в ААС-ЭТА анализе является хлорид-ион [106,196,223]. Мешающие влияние обусловлено потерями аналитов в форме хлоридов на стадии пиролиза и неполнотой атомизации [224]. Цельная кровь содержит примерно 0,55 масс.

% хлорида (0,9 масс. % хлорида натрия), поэтому использование только высокоэффективной коррекции не обеспечивает правильность анализа и необходима тщательно многопараметрическая оптимизация всех условий анализа: температурно-временной программы нагрева атомизатора (условия сушки, пиролиза, атомизации и очистки), а также разбавления проб и выбор подходящих модификаторов [190,195].

1.2.3.2 Химическая модификация в ААС-ЭТА Использование химических модификаторов является одним из наиболее эффективных путей устранения физико-химических и спектральных помех в ААС-ЭТА [225-227]. В рекомендациях IUPAC сказано [228]: “для влияния должным образом на процессы, происходящие в атомизаторе, туда могут быть добавлены реагенты, называемые химическими модификаторами. Они помогают сохранить аналит до более высоких температур во время стадии пиролиза, устранить нежелательные загрязнения или улучшить атомизацию другим способом”.

Прием химической модификации, в первую очередь, направлен на изменение химического состава термодинамической системы атомизатора («аналит – матрица пробы – материал поверхности атомизатора – газовая атмосфера атомизатора») на стадиях высушивания пробы, пиролиза матрицы пробы, атомизации определяемых элементов и очистки графитовой печи.

Воздействие модификатора может быть направлено на определяемый элемент, сопутствующие элементы или матричные компоненты пробы, материал поверхности или газовую фазу атомизатора [190].

Основные направления действия модификаторов это – снижение летучести легколетучих элементов, что позволяет повысить температуру пиролиза для более эффективного удаления матричных компонентов;

увеличение эффективности термодеструкции матрицы на стадии пиролиза;

перевод аналита в единую форму, что обеспечивает появление единственного пика атомизации, и, соответственно, позволяет увеличить чувствительность и точность определений; обеспечение лучшей пространственной изотермичности печи; уменьшение температуры атомизации, когда это необходимо; улучшение термоочистки печи и снижение «эффекта памяти» и др. [228-230].

В обзорах [37,231-233] приведены примеры эффективного использования химических модификаторов в ААС-ЭТА. Также большой раздел посвящен применению модификаторов в монографии А.С.

Алемасовой [234]. Для обеспечения максимальной температуры пиролиза при оптимизации температурно-временной программы нагрева печи используют неорганические и органические модификаторы, а также добавки газов восстановителей к защитному газу [235-237]. При разработке методик анализа биосубстратов наиболее эффективными являются неорганические модификаторы [238,239]: соли Pd, Ir, Rh, Pt, Au, Ag, Ru, имеющие высокие температуры кипения, легко восстанавливаемые на поверхности графитовой печи до элементарного состояния; соли Mg, Ca, образующие на стадии пиролиза высокотемпературные оксиды; фосфаты аммония или щелочных металлов, стабилизирующие аналиты в виде труднолетучих фосфатов [240,241]; карбидообразующие элементы W, Zr, Mo, Cr, La, U [242], взаимодействующие с углеродом поверхности атомизатора с образованием термоустойчивых карбидов, которые с одной стороны, препятствуют диффузии аналита вглубь стенок печи, а с другой, – удерживают определяемые элементы до прогрева газовой фазы в атомизаторе.

Анализ работ по определению элементов в биообъектах методом ААСЭТА показывает, что используют все виды модификаторов, однако наиболее часто проводят перманентную модификацию поверхности атомизатора W, Rh, Ru, Zr, Ir [201,243-245] в сочетании с традиционной модификацией матрицы с использованием солей Pd. В настоящее время все чаще отказываются от использования в качестве модификаторов матрицы нитрата палладия Pd(NO3)2 в пользу его восстановленных форм, например, в виде мелкодисперсной металлической фазы [126]. Также одновременно вводят соли палладия с восстановителем, например, аскорбиновой кислотой [246] или, водородом (добавлением к аргону 5% которые H2) [247], восстанавливают палладий и определяемый элемент практически одновременно, что способствует образованию стабилизированных форм аналитов на ранних стадиях нагрева печи. Традиционно [248] в качестве модификатора применяют смесь нитратов палладия и магния, позволяющую стабилизировать элементы в различных слоях пробы [201,249].

Несмотря на большое число работ, посвященных химической модификации, выявлению механизма действия модификаторов [231,239,250,251] и сравнения их эффективности [239], выбор последних при разработке методик, по-прежнему, чаще всего проводят эмпирически.

Модификаторы широко используют при прямом ААС-ЭТА определении микроэлементов в биологических жидкостях [201,243-246,249]. При анализе биообъектов с предварительным разложением проб модификаторы применяют сравнительно редко [121], в силу уменьшения уровня неселективного поглощения и устранения ряда физико-химических влияний за счет пробоподготовки.

1.2.3.3 Определение ртути с использованием техники «холодного пара»

В настоящее время, основным методом высокочувствительного определения ртути является применение техники «холодного пара» [65] в сочетании, в первую очередь, с атомно-абсорбционной спектрометрией [252а также атомно-флуоресцентной [254,256,257] и атомно-эмиссионной спектрометрией [258], масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой [259,260]. Данный методический приём основан на том, что даже при комнатной температуре металлическая ртуть легко испаряется, имеет высокое давление паров и в газовой фазе находится в атомарном состоянии.

Следует отметить, что ртуть является единственным элементом, помимо благородных газов, который образует одноатомные пары при комнатной температуре [190,261].

Для перевода ртути в элементное состояние применяют различные методы восстановления. Наиболее часто применяется химическое восстановление из растворов, которое было впервые предложено Н.С. Полуэктовым и др. [262] по-прежнему наиболее популярно. В настоящее время, в аналитической практике применяются специальные ртутные анализаторы и проточно-инжекционные системы, позволяющие проводить все химические операции – пробоподготовку (потоковое кислотное [263], микроволновое разложение [264,265], обработка окислителями, ультрафиолетовый фотолиз [257]), генерацию атомных паров ртути и их детектирование в автоматизированом режиме [252,257,264].

Помимо классического химического восстановления применяют также электрохимическое [256,266,267], фотохимическое [268-270] и пиролитическое восстановление [209,271].

Для снижения пределов обнаружения ртути в рамках техники «холодного пара» применяют амальгимирование [272,273,274] методы разделения и концентрирования [275,276].

Как уже было отмечено выше, наиболее часто техника «холодных паров» реализуется в комбинации с ААС. Для определения ртути применяют специальные кюветы с кварцевыми окнами, например [209,275,276].

Относительно небольшое число работ посвящено осаждению ртути в электротермическом атомизаторе, например, с применением различных модификаторов поверхности [274,277,278].

Применение техники «холодного пара» обеспечивает высокую чувствительность и хорошую воспроизводимость результатов [190,252], однако при анализе биологических жидкостей, как и в случае ААС-ЭТА с непосредственным введением пробы, в большинстве случаев идут по пути минерализации проб [253,255,265,279]. Таким образом, создание новой высокочувствительной схемы прямого определения содержания ртути в крови, с применением осаждения аналита в послойно модифицированной графитовой печи является актуальной задачей.

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ I

Анализ публикаций, посвященных элементному анализу биологических жидкостей, показывает, что, несмотря на значительный накопленный опыт клинического элементного анализа, проблема проведения прямого определения микроэлементов без предварительной минерализации проб до сих пор не решена в полной мере. Разработка методического подхода, позволяющего проводить прямое определение элементов в цельной крови, являлось целью данного исследования.

ГЛАВА II. ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА АНАЛИТИЧЕСКОГО МЕТОДАИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА АНАЛИТИЧЕСКОГО МЕТОДА

Атомно-абсорбционный анализ объектов сложного состава, в том числе, цельной крови, осложнен спектральными помехами и физикохимическими влияниями со стороны компонентов пробы и материала атомизатора.

Применение прямого подхода к элементному анализу биосубстратов имеет ряд преимуществ перед традиционным подходом, предполагающим предварительное разложение проб. Очевидно, что реализация прямого определения микроэлементов в цельной крови без применения эффективной коррекции неселективного поглощения практически невозможна в силу сложного матричного состава и высокого содержания органического вещества в биологических пробах, создающие значительные спектральные и физико-химические помехи при анализе.

Из существующих в настоящее время методов инструментальной коррекции неселективного поглощения наиболее часто в серийно выпускаемых атомно-абсорбционных спектрометрах применяют дейтериевую коррекцию и два основных варианта Зеемановской коррекции – Зеемановскую коррекцию с модуляцией напряженности магнитного поля и Зеемановскую модуляционную поляризационную коррекцию [193].

Эффективность дейтериевой коррекции ограничена спектральной, пространственной и временной негомологичностью, поэтому прямые методики на основе ААС-ЭТА для анализа образцов со сложным матричным составом практически не применяются. Анализ опубликованных работ показывает, что для прямого определения микроэлементов преимущественно применяют Зеемановскую коррекцию.

Теоретическое рассмотрение, представленное в главе I, позволяет ожидать более высокой селективности для метода ЗМПС за счет более высокой временной гомологичности, обеспечиваемой высокочастотной модуляцией. Для сравнения эффективности двух основных вариантов Зеемановской коррекции – с модуляцией поля и модуляцией поляризации использовали данные литературы (для коррекции с модуляцией поля) и собственные экспериментальные данные (для высокочастотной модуляции поляризации).

Опубликованных данных по предельным значениям абсорбционности, при которых еще возможно получить достоверные аналитические сигналы абсорбции, обнаружить не удалось. Как правило, рабочие значения абсорбционности составляют не более 0,5 [192,211-214], что, скорее всего, связано с недостаточной временной гомологичностью и, соответственно, недостаточной селективностью Зеемановской спектрометрии с модуляцией магнитного поля. Это приводит к тому, что при определении большинства элементов в крови приходится прибегать к предварительному разложению пробы [124,126,132], что связано с дополнительными аналитическими трудностями и возможным систематическим погрешностям. Небольшое число работ по прямому анализу в основном посвящены определению кадмия [280] и свинца [243]. Проблему недостаточной временной гомологичности при высоком неселективном поглощении при определении этих элементов решают многократным разбавлением проб крови, поскольку содержания свинца в крови порядка 100 мкг/л, а чувствительность определения кадмия методом ААС-ЭТА соизмерима с ИСП-МС.

Для того чтобы сравнить возможности двух вариантов Зеемановской коррекции неселективного поглощения провели оценку влияние величины неселективного поглощения (Ан.с.) на аналитические сигнал абсорбции элементов (А) при использовании ЗМПС. Для этого измеряли сигналы абсорбции бериллия, кадмия и свинца, моделируя неселективное поглощение с использованием раствора сахарозы и аминокислот с концентрациями 1-10 масс. % (рисунок 1).

Рисунок 1. Зависимость интегрального аналитического сигнала абсорбции (А) Be, Cd и Pb от интенсивности неселективного поглощения (Ан.

с.). В атомизатор вводили 4 пг Be, 5 пг Cd и 50 пг Pb. Для увеличения неселективного поглощения использовали раствор сахарозы и аминокислот (1-10 масс. %). Sn определен по 5 параллельным определениям Из вида зависимости аналитического сигнала элементов от оптической плотности неселективного поглощения следует, что метод ЗМПС дает возможность работать при оптических плотностях, значительно превышающих 0,5 единиц. Рост стандартного отклонения (Sn) при оптической плотности неселективного поглощения свыше 1,5 обусловлен ослаблением светового потока, что приводит к значительным дробовым шумам из-за малого количества регистрируемых фотонов. Высокая временная гомологичность ЗМПС позволяет регистрировать адекватные аналитические сигналы абсорбции элементов даже при значениях оптической свыше 2,0 единиц. Возможность работы при оптических плотностях на уровне 1,5 единиц позволяет качественно улучшить правильность и чувствительность определений при анализе проб со сложным матричным составом, в частности для неминерализованных проб крови. Таким образом, высокая временная гомологичность ЗМПС обеспечивает ее преимущество перед классическим вариантом Зеемановской коррекции с модуляцией магнитного поля. Поэтому данный метод был выбран для создания методик прямого определения микроэлементов в крови человека.

2.2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

При разработке методического подхода к решению задачи прямого определения бериллия, кадмия, свинца, таллия и ртути в цельной крови были использованы общие рекомендации по обеспечению качества измерений.

При разработке и аттестации методик показатели сходимости, воспроизводимости, правильности и точности рассчитывали в соответствии с рекомендациями Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации [281-284].

Для доказательства правильности применяли анализ стандартных образцов состава (СО) крови с аттестованными концентрациями ртути, таллия, бериллия, кадмия и свинца и метод стандартных добавок.

2.2.1 Аппаратура Атомно-абсорбционный спектрометр МГА-915 с 2.2.1.1 высокочастотной Зеемановской модуляционной поляризационной коррекцией фона Метод атомно-абсорбционной спектрометрии основан на резонансном поглощении света свободными атомами анализируемого элемента в газовой фазе. Формирование аналитического сигнала происходит при пропускании резонансного электромагнитного излучения через слой атомного пара в графитовой печи Зеемановского атомно-абсорбционного анализатора МГАМД. Принципиальная схема спектрометра представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Принципиальная схема атомно-абсорбционного спектрометра МГА-915МД Спектрометр состоит из источника резонансного излучения 1, помещенного в револьверную систему; объективов 2, 8 и 12; поворотного зеркала 3; поляризатора 4; оптоаккустического модулятора 5 (ОАМ);

наклонной кварцевой пластины 6; фазовой пластины 7; кварцевых окон 9;

атомизатора 10; магнита 11; формирователя изображения входной щели монохроматора 13; входной щели монохроматора 14; зеркальной сферической дифракционной решетки 15; выходной щели монохроматора 16;

фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) 17; усилителей и аналого-цифровых преобразователей 18; компьютера 19 [285].

Пространственное расположение оптических элементов следующее:

излучение распространяется вдоль оси, которая перпендикулярна направлению силовых линий магнитного поля магнита;

длинная ось ОАМ параллельна направлению силовых линий магнитного поля магнита;

оси поляризатора и фазовой пластины /4 повернуты в плоскости, перпендикулярной оптической оси, на угол 45°;

наклонная пластина повернута в плоскости, перпендикулярной оптической оси, на угол 45° и наклонена к оптической оси на угол 60°.

Принцип действия анализатора основан на использовании метода Зеемановской модуляционной поляризационной спектроскопии с высокочастотной модуляцией, который является одним из вариантов селективного атомно-абсорбционного анализа [193,215,286].

Коррекция неселективного поглощения фона реализована следующим образом. Атомизатор (графитовая печь Массмана) находится в поперечном постоянном магнитном поле напряженностью 7,5кЭ. Свет, пройдя через оптическую систему, становится модулированным по поляризации, причем, частота модуляции равна собственной частоте ОАМ () и соответствует 50кГц.

Интенсивность излучения, прошедшего через атомизатор и достигшего

ФЭУ, как функция времени выражается формулой:

J(t)=S0+S1sint+S2sin2t+…, где S0 – постоянная составляющая полного сигнала, S1 и S2 – амплитуды гармоник по частоте и 2, соответственно. S1 зависит от концентрации поглощающих атомов, а S2 пропорциональна интенсивности первичного излучения.

Для устранения влияния неселективного ослабления и дрейфов источника излучения аналитическим сигналом служит отношение S1 и S2:

A=S1/S2 Окончательное выражение для аналитического сигнала Sa, в котором учтена зависимость от времени и частично лианеризована зависимость от концентрации определяемых атомов n при больших оптических плотностях (Qnl = 0,5 5, где l – толщина поглощающего слоя) имеет вид:

b S t Sa t dt 2 ln b S t dt, где b – нормировочная константа b b Sa [285].

Для перевода определяемого элемента в состояние атомного пара в приборе МГА-915МД используются электротермические атомизаторы – графитовые печи Массмана с продольным нагревом.

Высокоэффективная коррекция неселективного поглощения на основе ЗМПС и высокая скорость нагрева атомизатора (8000 С/с), реализованные в спектрометре МГА-915МД, обеспечивают высокую чувствительность и хорошую селективность анализа, что позволяет эффективно решать проблему определения низких концентраций микро- и ультрамикроэлементов в сложных органических пробах, таких как цельная кровь.

2.2.1.2 Источники электромагнитного излучения В качестве источника электромагнитного излучения при определении Be использовали лампу с полым катодом (Кортек, Россия).

Лампы с полым катодом [202,287,288] являются наиболее стабильными источниками резонансных спектральных линий, но обладают следующими недостатками:

сравнительно низкая интенсивность резонансного излучения;

сложные спектры излучения, так как в разряде кроме атомных линий испускания имеются линии ионов;

низкая надежность ламп для легколетучих элементов:

Поэтому для более легкоплавких и легколетучих элементов (Cd, Hg, Pb и Tl) использовали высокочастотные безэлектродные лампы (Люмекс).

Для высокочастотных ламп [289,290] характерно низкое уширение спектральных линий, поскольку разряд в высокочастотном электромагнитном поле происходит в тонком слое вблизи стенок баллона.

Увеличение мощности возбуждения повышает испаряемость соединения элемента и, следовательно, интенсивность излучаемых спектральных линий.

Однако для легколетучих элементов интенсивность резонансных линий может с увеличением мощности уменьшаться, так как при этом существенно возрастает парциальное давление паров элемента и его резонансная линия в значительной мере самопоглощается. Другой существенной проблемой является значительный дрейф чувствительности, связанный с изменением яркости лампы в результате изменения температуры окружающей среды.

Однако при оптимальных значениях подведенной мощности интенсивность высокочастотных ламп в 10-50 раз выше, чем ламп с полым катодом [193].

К недостаткам высокочастотных безэлектродных ламп можно отнести следующее:

необходимость иметь дополнительный блок питания – высокочастотный генератор;

стабильность работы ниже, чем у ламп с полым катодом;

время прогрева для достижения оптимальных параметров излучения составляет 20-40 минут, в то время как ламп с полым катодом только 5-20 минут. Однако следует отметить, что для Зеемановских спектрометров прогрев источников излучения фактически не является строго необходимым, поскольку изменение интенсивности излучения влияет только на пределы обнаружения, а сам аналитический сигнал остается неизменным.

Аналитические сигналы абсорбции измеряли при длинах волн соответствующего резонансного перехода: Be 234.9 нм; Cd 228.9 нм; Hg

253.7 нм; Pb 283.3 нм и Tl 276.8 нм.

2.2.1.3 Графитовый атомизатор Массмана

Устройство печи Массмана иллюстрирует рисунок 3:

Рисунок 3. Устройство печи Массмана

Графитовая кювета с пиропокрытием [291] (длина 28 мм, внутренний диаметр 6 мм) помещается в графитовые конические контакты. К контактам подводится электрический ток от блока питания. При прохождении через кювету сильного тока 500-1000 А она нагревается. Через маленькое дозировочное отверстие в атомизатор с помощью дозатора вводится проба объемом 5-40 мкл. Проба нагревается, испаряется и атомизируется. Во время анализа печь помещается в защитную аргоновую атмосферу. Аргон защищает материал атомизатора от разрушительного воздействия кислорода воздуха [193]. Внешний поток защитного газа обдувает печь снаружи.

Внутренний поток аргона поступает в печь через отверстия в графитовых контактах.

При работе с печами Массмана следует учитывать, что для атомизаторов с продольным нагревом характерна пространственная неизотермичность, обусловленная неоднородностью распределения температуры вдоль печи – края оказываются более холодными, чем центральная часть печи. Более низкая температура краев атомизатора, с одной стороны, снижает чувствительность, а с другой, увеличивает «эффект памяти» за счет осаждения атомных паров на более холодных участках атомизатора и их последующей реатомизации при последующих циклах анализа. Насечки по краям печи Массмана (рисунок 3) обеспечивают более равномерный прогрев атомизатора, улучшая пространственную изотермичность печи, решая проблему осаждения аналита на более холодных участках атомизатора.

Помимо пространственной неизотермичности для всех электротермических атомизаторов характерна также временная неизотермичность, связанная с отставанием роста температуры газовой фазы от температуры стенок атомизатора. Это приводит, с одной стороны, к потерям аналита в результате газового выноса через края печи и дозировочное отверстие атомизатора, поскольку непрогретая газовая фаза продолжает температурное расширение после атомизации аналита. С другой стороны, в случаях, когда аналит присутствует в пробе в форме сравнительно легколетучих и устойчивых в газовой фазе соединений (например, галогенидов) или образование таких соединений возможно в процессе анализа в результате взаимодействия аналита с компонентами матрицы, материалом атомизатора или модификаторами, то испарение таких летучих форм в недостаточно прогретую газовую фазу атомизатора может приводить к неконтролируемым потерям аналита в неатомизированной форме.

Для устранения проблем, связанных с временной неизотермичностью графитовых атомизаторов, Б.В.Львов предложил вводить пробу не на стенку печи, а на маленькую графитовую платформу с пиропокрытием [196,197].

Уолтер Славин включил применение печей с платформой в свою концепцию SPTF в качестве одного из основополагающих пунктов [195].

Платформа вставляется в специальные направляющие пазы внутри графитовой кюветы или выполняется интегрированной. В каждом случае она имеет минимальный термический контакт со стенками графитовой печи, поэтому нагревается преимущественно за счет радиационного излучения стенок графитовой трубки. Мощность радиационного излучения, согласно закону Вина, пропорциональна температуре стенок трубки в четвертой степени. Следовательно, в начальной стадии нагрева платформа остается холодной, испарение атомов элементов практически не происходит и обеспечивается более высокая временная изотермичность атомизатора.

Платформа препятствует потерям легколетучих элементов, позволяет создать большую плотность атомных паров, что улучшает чувствительность определения элементов в 1,5 – 2 раза. Печи с платформой Львова широко используются в практике электротермического анализа для проб со сложной матрицей [5,216-222,292].

2.2.1.4 Ртутно-гидридная приставка РГП-915 Возможным путем снижения физико-химических и спектральных помех при проведении элементного анализа является применение отгонки аналита в форме летучих соединений. В случае ртути проводят отгонку элементных паров, что лежит в основе метода определения ртути в различных объектах анализа – техника «холодного пара». Данная схема определения ртути отличается гибкостью, возможностью применения в сочетании с различными вариантами конечного детектирования, такими как методы атомной (ААС, АФС, ИСП-АЭС) и масс-спектрометрии (ИСП-МС), а также хроматографические и хромато-масс-спектрометрические методы.

Техника «холодного пара» обеспечивает высокую сходимость, повторяемость, точность результатов определения, а также низкие пределы обнаружения ртути [252].

В данной работе для генерации паров ртути использовали ртутногидридную приставку РГП-915 (рисунок 4).

Рисунок 4. Схема ртутно-гидридной приставки РГП-915 2.

2.1.5 Анализатор ртути РА-915+ При выборе условий восстановления ртути и ее отгонки в атомизатор дополнительно применяли анализатор ртути РА-915+.

Как и в случае МГА-915МД, принцип действия анализатора РА-915+ основан на ЗМПС. Однако в данном случае реализован прямой эффект Зеемана – источник излучения помещен в магнитное поле. Резонансная линия излучения ртути = 253,7 нм расщепляется на три поляризованные Зеемановские линии (, + и - соответственно). При наблюдении излучения вдоль направления силовых линий магнитного поля регистрируется излучение только -компонент, причем одна -компонента находится под контуром линии поглощения, а другая – вне его. В отсутствие паров ртути интенсивность излучения обеих -компонент линии излучения ртути будут равны. При появлении поглощающих атомов разность интенсивностей компонент ртути -компонент будет тем больше, чем больше концентрация ртути.

Разделение -компонент во времени происходит с помощью поляризационного модулятора. Спектральное смещение -компонент значительно меньше ширины полос поглощения и спектров рассеяния, что дает возможность учитывать неселективное поглощение.

2.2.2 Анализируемые образцы Гепаринизированные пробы крови были предоставлены токсикологической поликлиникой ФГБУН «Институт токсикологии»

Федерального Медико-биологического агентства России. Пробы крови отбирали в утреннее время, натощак, в положении сидя из локтевой вены.

Для пробоотбора применялись вакуумные системы для взятия крови (Vacutest®, Vacutest KIMA, Италия).

2.2.3 Реактивы и материалы Рабочие стандартные растворы ионов металлов (Be, Cd, Hg, Pb, Tl) готовили разбавлением деонизованной водой ГСО водных растворов ионов соответствующих металлов (ЦИКВ, Санкт-Петербург, Россия), ГСО (Be – ГСО № 7759-2000; Cd – ГСО № 6690-93; Pb – ГСО № 7012-93; Tl – ГСО № 6081-91)в мерных колбах объемом 100 мм3. Деионизированная вода была получена на установке Millipore Advantage, Франция, (18,2 МОмсм).

Градуировочные растворы готовили разбавлением рабочих стандартных растворов раствором азотной кислоты с объемной долей 2%, (ос.ч., ГОСТ ОАО «Реактив», Россия). Для поддержания высокого 11125-84, окислительного потенциала в рабочий стандартный раствор ионов ртути дополнительно вводили K2Cr2O7 (ГОСТ 4220-75, ОАО «Реактив») из расчета 1 г на 100 мл.

В работе применяли следующие реактивы: концентрированная соляная кислота (ос.ч., ГОСТ 14261-77, ОАО «Реактив», Россия); гидроксид натрия (ос.ч., Merck, Германия); борогидрид натрия (Fluka, Германия); Тритон Х-100 ((п-(трет-октил)-фениловый эфир полиэтиленгликоля, Amresco, США);

вольфрамата натрия Na2WO4 (ГОСТ 18289-78, ОАО «Реактив»); гексагидрат гексахлорплатиновой кислоты Н2PtCl6 (Merck, Германия); хлорид рутения RuCl3 (III) RhCl3 (Merck, Германия); хлорид золота (III) AuCl3 (Merck, Германия); нитрат аммония NH4NO3 (ос.ч., ТУ 6-09-292-75, ОАО «Реактив», Россия); нитрат лития LiNO3 (ГОСТ 10562-76, ОАО «Реактив»); нитрат палладия Pd(NO3)2 (10 г/дм3 раствор для атомно-абсорбционного анализа, Merck, Германия).

Для построения градуировочных характеристик в подготовленные графитовые печи дозатором вводили градуировочные растворы (не менее 5 растворов на диапазон определяемых концентраций). Ввод градуировочного раствора для каждой концентрации повторяли 5 раз. Аналитические сигналы регистрировали в соответствии с оптимизированными параметрами анализа.

Градуировочная характеристика выражалась прямолинейной зависимостью среднего аналитического сигнала от массы компонента. Градуировочную характеристику считали приемлемой, если относительное стандартное отклонение аналитических сигналов для каждого градуировочного раствора не превышало 6 %.

Подготовку оборудования к анализу проводили в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Для мытья химической посуды использовали концентрированную серную кислоту и концентрированную азотную кислоту.

Для оценки пределов обнаружения применяли критерий 3, при десятикратном измерении шумового сигнала в оптимизированных условиях.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕРИЛЛИЯ В КРОВИ

Из элементов, выбранных для данного исследования, бериллий является наиболее трудноатомизируемым металлом. По данным [293,294], температура атомизации бериллия составляет свыше 2500C, поэтому для данного элемента возможно применение достаточно высоких температур пиролиза без потерь аналита, что упрощает процесс многопараметрической оптимизации условий анализа.

Предварительно исследовали следующие модификаторы поверхности графитового атомизатора – Na2WO4, H2PtCl6 [295]. Модификаторы выбирали исходя, в первую очередь, из высоких температур плавления карбида вольфрама и платины, образующихся при обработке графитовой поверхности указанными реактивами. Оказалось, что применение модификаторов поверхности практически не влияет на величину аналитического сигнала бериллия. Поэтому от применения модификаторов поверхности отказались и использовали немодифицированный атомизатор Массмана с интегрированной платформой Львова.

После выбора атомизатора оптимизировали температурно-временную программу нагрева атомизатора. Для выбора температуры атомизации регистрировали аналитический сигнал абсорбции, вводя в атомизатор 10 мкл раствора с концентрацией ионов бериллия 0,2 мкг/л. Зависимость аналитического сигнала бериллия от температуры атомизации представлена на рисунке 5.

Рисунок 5. Выбор оптимальной температуры атомизации при определении Be (n = 5).

В атомизатор вводили 2 пг Be, пошаговое изменение температуры атомизации на 100°С при прочих равных условиях Температуру пиролиза выбирали аналогичным образом. Температуру пиролиза изменяли от 400 до 800С, при времени пиролиза 16 с и прочих равных условиях (рисунок 6).

Рисунок 6. Зависимость измеряемого абсолютного содержания Be от температуры пиролиза.

Время пиролиза 20 секунд. В атомизатор вводили 2 пг Be (n = 5). Разбросы соответствуют стандартному отклонению (± Sn, пг) Как видно из рисунка 6, при анализе стандартных растворов имеет место рост величины абсорбционности при увеличении температуры пиролиза вплоть до 700С. При этом можно наблюдать две области графика (I и II).

Для области I характерно малое изменение сигнала с ростом температуры пиролиза. Для области характерен более выраженный рост II (приблизительно на 25%). Вероятно, это связано с влиянием различных химических форм бериллия.

При более низких температурах пиролиза (область I) нитрат бериллия из стандартного раствора преимущественно разлагается до оксида BeO:

–  –  –

и атомизация происходит преимущественно из этой формы. При более высоких температурах пиролиза (область II) помимо разложения Be(NO3)2 до BeO, происходит также восстановление оксида бериллия до карбида Be2C по реакции:

–  –  –

Карбид является менее термостойким соединением бериллия по сравнению с оксидом: Tпл.(BeO) = 2570±30C, Tкип.(BeO) = 4260±160C [296];

Tпл.(BeO) = 2570±30C, Tпл.(Be2C) = 2325±75C [297], по Tкип.(Be2C) нет данных [298], т.к. соединение разлагается выше температуры плавления).

Таким образом, перевод аналита в форму карбида уменьшает потери аналита на стадии атомизации на фронте подъема температуры в виде неатомизированного оксида бериллия:

BeO(тв.) + C(тв.) Be(тв.) + CO(г.) + [BeO(г.)]

Потери аналита возникают в силу значительной термостойкости и высокой энергии связи BeO (-720,3 кДж/моль для молекул [299]) даже при использовании платформы Львова и высокой скорости нагрева, реализованной в используемом спектрометре.

Другим возможным объяснением может быть термогидролиз нитрата бериллия на стадии сушки с образованием гидроксида:

–  –  –

Таким образом, в отсутствие пиролиза атомизация может происходить из формы гидроксида. При этом на стадии атомизации должно ступенчато происходить сначала разложение гидроксида, а затем восстановление оксида бериллия углеродом. Поэтому возможны потери бериллия или в виде неатомизированного оксида или за счет распыления микрочастиц оксида при его образовании из гидроксида с выделением паров воды. Возможно, реализуются оба процесса. В любом случае, предварительный пиролиз переводит аналит в более удобную форму для атомизации, что обеспечивает увеличение аналитического сигнала при использовании более высоких температур пиролиза. Оптимальная температурно-временная программа определения бериллия представлена в таблице 2.

–  –  –

При анализе проб крови возможно матричное влияние хлорида из-за образования хлорида бериллия BeCl2. Хлорид бериллия характеризуется относительной летучестью, поэтому возможны потери аналита на стадии пиролиза и атомизации. Влияние хлорида оценили при его концентрациях, соответствующих дву-, пяти-, десяти- и двадцатикратноразбавленной крови.

Для этого измеряли сигнал абсорбции бериллия в приготовленных модельных растворах, содержащих 0,2 мкг/л Be и 0,05; 0,10; 0,2; 0,5 масс. % соответственно. Измерения проводили при оптимизированных NaCl параметрах ТВП. Результаты представлены на рисунке 7.

Рисунок 7. Зависимость аналитического сигнала абсорбции бериллия (А) от концентрации хлорида в матрице (n = 5) Из полученных данных следует, что при концентрациях хлорида 0,2 масс.

% NaCl, соответствующих минимально возможному для крови пятикратному разбавлению, влияние хлорида отсутствует. С увеличением концентрации хлорид-иона происходит увеличение относительного стандартного отклонения с 7 до 13%, связанное с ростом неселективного поглощения и статистической ошибки.

Для оценки эффективности пиролиза проб крови изучили влияние нескольких нитрат содержащих модификаторов матрицы, которые вводили в качестве окислителей после введения пробы крови. Для выбора модификатора окисления проводили измерение аналитического сигнала бериллия в пяти- и десятикратно разбавленной крови, содержащей добавку стандартного раствора бериллия 0,2 мкг/л. Использовали традиционные модификаторы окисления – нитрат аммония массовая доля 2% [300,301], азотную кислоту объемная доля 2 % [302], и нитрат палладия [190,248].

Результаты представлены в таблице 3.

–  –  –

В результате проведенных исследований отказались от использования модификаторов окисления, поскольку их применение практически не приводит к улучшению вспроизводимости сигнала и не влияет на его величину в пределах статистического разброса.

После выбора оптимальных условий проведения анализа оценили составляющие погрешности разработанной методики и основные метрологические характеристики. Для оценки правильности во всем динамическом диапазоне использовали метод стандартных добавок.

Доказательство правильности проводили с использованием стандартного образца состава крови Seronorm™ Trace Element Whole Blood L-3.

Измеренное значение концентрации бериллия в стандартном образце (С ± P=0,95;n=6 = 13,1 ± 0,7 мкг/л) совпадает с паспортным значением (12,4±0,7 мкг/л) в пределах статистического разброса, что является надежным подтверждением правильности. Основные характеристики разработанной методики представлены в таблице 4.

–  –  –

Примечание – * – Предел обнаружения оценен по 3 критерию (n = 10) ** – нижняя граница соответствует пределу определения (10, n = 10) с учетом разбавления крови *** – соответствует середине динамического диапазона Литературные данные по определению бериллия в крови методом ААС-ЭТА ограничены. Основное внимание исследователи уделяют определению бериллия в моче [303]. Удалось обнаружить всего одну работу по ААС-ЭТА определению бериллия в крови с использованием Зеемановской коррекцией после 8-кратного разбавления проб [294]. Однако заявленный авторами предел обнаружения бериллия в крови 0,009 мкг/л вызывает серьезные сомнения, поскольку такие низкие ПО бериллия невозможно получить даже для чистых стандартных растворов с использованием метода атомно-абсорбционной спектрометрии.

В таблице представлено сравнение разработанной аналитической схемы определения бериллия с имеющимися литературными данными.

–  –  –

Разработанная схема определения бериллия характеризуется наиболее простой процедурой подготовки проб к анализу. Сравнение с методиками, основанными на ААС-ЭТА, показывает, что разработанная схема наиболее простая, так как не требует даже использования модификации.

Достигаемый предел обнаружения (0,08 мкг/л) не уступает ПО для ИСП-МС без предварительной минерализации проб крови и позволяет надежно определять нижнюю границу токсических и субтоксические концентрации бериллия в крови человека. Определение микроэлемента в пробах крови людей, проживающих в г. Санкт-Петербурге и не имеющих профессионального контакта с бериллием, показало, что концентрации бериллия в крови оказываются ниже предела обнаружения (0,08 мкг/л) разработанной методики. Это совпадает с данными ИСП-МС биомониторинга здорового городского населения [122] и значительно ниже данных более раннего ИСП-АЭС исследования [34]. Согласно данным [306] токсическая концентрация бериллия составляет 20 мкг/л. Таким образом, методика обладает значительным запасом чувствительности, позволяет измерять субтоксические количества бериллия, что важно при проведении биомониторинга производств с вредными условиями труда.

3.2 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАДМИЯ И СВИНЦА В КРОВИ

Определение свинца и кадмия в биосредах человека – традиционная задача клинического анализа. Несмотря на наличие большого количества работ по определению кадмия и свинца в крови и других биологических объектах методом ААС-ЭТА, в настоящее время практически отсутствуют методики прямого определения этих элементов в крови.

Кадмий и свинец относятся к относительно легколетучим элементам, поэтому, в первую очередь, были исследованы модификаторы поверхности, предлагаемые для определения Cd и Pb различными авторами. Использовали следующие модификаторы: Pd(NO3)2, RuCl3, RhCl3, H2PtCl6, Na2WO4 [37,201,232,243,307]. Для увеличения срока службы графитового атомизатора применяли модификацию только поверхности интегрированной платформы Львова. Для этого в атомизатор вводили 20 мкл раствора соответствующего модификатора и использовали высокотемпературный отжиг согласно температурно-временной программе модификации. Процедуру повторяли не менее 5 раз. Температурно-временные параметры модификации выбирали таким образом, чтобы они обеспечивали разложение исходных веществ, восстановление металлов углеродом и удаление матричных компонентов.

Условия модификации представлены в таблице 6.

–  –  –

В процессе отжига Na2WO4, взаимодействуя с углеродом, восстанавливается до карбида вольфрама (WC), который препятствует диффузии аналитов вглубь пиропокрытия атомизатора, уменьшает теплопроводность графита, а также защищает пирографитовую поверхность от коррозии. Pd(NO3)2, H2PtCl6 и другие соли платиновых металлов образуют на поверхности печи тонкий слой соответствующего металла, способствующий лучшему удерживанию аналита поверхностью атомизатора и стимулирующий термодеструкцию матрицы в процессе пиролиза [231].

Для выбора модификатора в подготовленный атомизатор вводили 10 мкл стандартного раствора свинца с концентрацией 2,5 мкг/л и 10 мкл стандартного раствора кадмия с концентрацией 0,1 мкг/л. Данные по выбору модификаторов поверхности (при индивидуально оптимизированных температурах атомизации) приведены на рисунке 8.

Рисунок 8. Выбор модификаторов поверхности при определении кадмия и свинца.

Сигналы абсорбции (А) получены при оптимизированных температурах атомизации элементов для соответствующего модификатора (n = 5) Из рисунка 8 следует, что в случае свинца применение модификаторов не приводит к значительному выигрышу в чувствительности и воспроизводимости результатов анализа, поэтому при определении свинца от применения модификаторов поверхности отказались. В случае кадмия использование модификаторов обеспечивает более высокую энергию связи аналит-поверхность и препятствует газовому выносу аналита на фронте подъема температуры атомизации. Наиболее высокая чувствительность и оптимальная воспроизводимость были получены при модификации поверхности соединениями родия. Однако платина также может быть рекомендована в качестве модификатора поверхности в силу большей доступности, так как эффективность модификации незначительно уступает солям родия.

Для оптимизации температур атомизации и пиролиза измеряли аналитические сигналы абсорбции кадмия и свинца для стандартных растворов данных элементов с концентрациями и 0,1 мкг/л для кадмия и 10 мкг/л для свинца при пошаговом увеличении температуры атомизации и пиролиза соответственно. Полученные данные представлены на рисунках 9 и 10.

Рисунок 9. Выбор оптимальной температуры атомизации при определении Cd и Pb (n = 5).

В атомизатор вводили 1 пг Cd и 100 пг Pb, пошаговое изменение температуры атомизации на 100°С, время атомизации 2 с, модификатор поверхности платформы для Cd – H2PtCl6 Рисунок 10. Выбор оптимальной температуры пиролиза при определении Cd и Pb (n = 5). В атомизатор вводили 1 пг Cd и 100 пг Pb, время пиролиза 20 с, модификатор для поверхности платформы Cd – H2PtCl6 На основании полученных данных (рисунки 9 и 10) были выбраны оптимальные температуры атомизации и пиролиза при ААС-ЭТА определении свинца с использованием немодифицированной печи с платформой и кадмия с использованием печи с интегрированной платформой, модифицированной платиной.

В выбранных температурно-временных условиях изучили влияние хлорид-иона на аналитические сигналы свинца и кадмия с использованием растворов, моделирующих дву-, пяти-, десяти- и двадцатикратно разбавленную кровь (рисунок 11). Использовали следующие концентрации определяемых элементов: 0,2 мкг/л для кадмия и 10 мкг/л для свинца.

Рисунок 11. Уменьшение сигнала абсорбции (А) кадмия и свинца при переходе от чистых стандартных растворов к хлоридсодержащим матрицам.

Измерение при оптимизированных параметрах ТВП. Для определения кадмия поверхность интегрированной платформы модифицирована H2PtCl6 (n = 5) Из рисунка 11 следует, что в отличие от бериллия наблюдается значительное мешающее влияние хлорида при его концентрации на уровне 0,2 масс. % NaCl и менее. Имеет место существенное занижение аналитического сигнала абсорбции кадмия и свинца.

Помимо изучения мешающих влияний хлорида на модельных растворах (рисунок 11), мешающее влияние матрицы крови изучили с использованием реальных образцов крови человека. Для этого анализировали пробы человеческой крови разбавленной в 5, 10 и 20 раз по объему деионизованной водой, и пробы крови со стандартными добавками кадмия и свинца.

Результаты представлены в таблице 7.

–  –  –

Полученные данные были проанализированы с использованием tраспределения Стьюдента. Сравнивали экспериментально найденное значение добавки с аттестованным значением Cат., а также значение концентрации, полученное с использованием десятикратного разбавления проб с удвоенным значением концентрации для двадцатикратного разбавления и значение для пятикратного разбавления с удвоенным значением для десятикратного. Для оценки эффективности действия модификатора сравнивали данные, полученные при введении модификатора и без него. Результаты для кадмия представлены в таблице 8; для свинца в таблице 9.

–  –  –

Из полученных данных можно заключить, что при анализе реальных образцов крови влияние хлорида, наблюдаемое для модельных растворов (рисунок 11), практически отсутствует при двадцатикратном разбавлении проб в случае кадмия. В случае свинца возможно применение десятикратного разбавления. При этом даже для пятикратно разбавленной крови для обоих элементов наблюдалось незначительное неселективное поглощения, то есть можно предположить, что занижение сигнала связано именно с матричными влияниями неспектрального характера. Для устранения матричных эффектов при определении кадмия и свинца эксперименты повторили с реальной пробой крови с введением традиционного модификатора матрицы – нитрата палладия с концентрацией 1 г/л. Данный модификатор не только способствует эффективному окислению органической матрицы при умеренных температурах пиролиза, но и стабилизирует аналиты во всех слоях пробы [121,308]. Модификатор вводили в атомизатор после введения анализируемой пробы, объем аликвотной порции модификатора 10 мкл.

Результаты представлены в таблице 10.

–  –  –

Оценку эффективности нитрата палладия в качестве модификатора провели с использованием t-распределения Стьюдента. Результаты для кадмия приведены в таблице 11, для свинца – в таблице 12.

Таблица 11. – Влияние модификатора Pd(NO3)2 на аналитический сигнал абсорбции кадмия в реальных образцах крови человека с использованием методов удвоения пробы и стандартных добавок при разных факторах разбавления крови (tтабл.f = 10; P = 0,95 = 2,228) Сат., мкг/л, мкг/л Sij t

–  –  –

Таблица 12. – Влияние модификатора Pd(NO3)2 на аналитический сигнал абсорбции свинца в реальных образцах крови человека с использованием методов удвоения пробы и стандартных добавок при разных факторах разбавления крови (tтабл.f = 10; P = 0,95 = 2,228) Сат., мкг/л, мкг/л Sij t

–  –  –

Из полученных данных следует, что модификация пробы раствором нитрата палладия позволяет устранить мешающие влияния матрицы и использовать меньшие степени разбавления проб крови. С модификатором матрицы оптимальная степень разбавления составляет 1/10 для кадмия и 1/5 для свинца. Значительно меньшее влияние хлоридов при анализе реальных проб крови можно, объяснить тем, что фосфаты и органические тиолы (глутатион, протеины и др.), содержащиеся в крови, способствуют удерживанию аналитов, то есть обладают модифицирующими свойствами.

Применение нитрата палладия, вероятно, увеличивает эффективность данных «внутренних модификаторов», так в случае чистых растворов для данного модификатора полного восстановления величины аналитического сигнала не наблюдалось. Для концентрации хлорида 0,10 масс %, соответствующей десятикратному разбавлению крови, обнаружено занижение аналитического сигнала на 20-30% для кадмия и 30-40% для свинца. Таким образом, в случае определения кадмия и свинца в крови было обнаружено «модифицирующее влияние матрицы» крови.

Оптимизированные температурно-временные программы определения кадмия и свинца на спектрометре МГА-915МД представлены в таблице 13.

–  –  –

После оптимизации параметров определения свинца и кадмия в крови оценили правильность разработанных методик, проанализировав стандартные образцы состава крови Seronorm™ Trace Element Whole Blood L-1 и L-3. Результаты анализа стандартного образца состава крови представлены в таблице 14.

–  –  –

Полученные значения концентраций свинца и кадмия соответствуют аттестованным значениям (таблица 14), что является надежным подтверждением правильности измерений. Дополнительную валидацию во всем диапазоне определяемых концентраций проводили с использованием метода стандартных добавок. Также оценили основные характеристики методик, они представлены в таблице 15.

–  –  –

Примечание – * – Предел обнаружения оценен по 3 критерию (n = 10) ** – нижняя граница соответствует пределу определения (10, n = 10) с учетом разбавления крови *** – соответствует середине динамического диапазона В случае кадмия и свинца столь низкие пределы обнаружения не являются строго необходимыми при анализе крови, так как референтные концентрации этих элементов достаточно велики. Согласно различным источникам [4,9] референтные концентрации кадмия и свинца в крови составляют 1,0 – 15 мкг/л для кадмия и 8 – 269 мкг/л для свинца. Исходя из достаточного уровня чувствительности и того факта, что при двадцатикратном разбавлении проб крови нет необходимости в использовании модификатора матрицы возможно использование упрощенной схемы анализа, то есть использование двадцатикратного разбавления проб для определения как кадмия, так и свинца без модификаторов матрицы. Правильность такой схемы анализа помимо метода стандартных добавок (см. таблицы 8-10) также была подтверждена анализом стандартного образца состава крови (таблица 16).

–  –  –

Анализ таблицы 17 показывает, что разработанные методики по пределам обнаружения уступают методикам на основе ИСП-МС. Тем не менее, полученные пределы обнаружения позволяют надежно определять фоновые и токсические концентрации свинца и кадмия в крови человека [4,60] даже при использовании упрощенной схемы с двадцатикратным разбавлением проб. Предлагаемые методики не требуют не только разложения проб, но также использования модификаторов матрицы и специальных смесей для разбавления.

3.3 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАЛЛИЯ В КРОВИ

На предварительном этапе разработки методики определения таллия в крови было обнаружено, что при определении таллия с использованием немодифицированного графитового атомизатора с платформой Львова наблюдается плохая воспроизводимость результатов анализа (SR 15%) даже для стандартных растворов ионов Tl. Поэтому определение таллия целесообразно было проводить только с применением модификации поверхности.

В качестве модификаторов поверхности использовали соли платиновых металлов Pd, Pt, Ru, Rh. Эффективность использования таких модификаторов при определении таллия в объектах окружающей среды показана в работе [313].

Для увеличения срока службы графитового атомизатора проводили перманентную модификацию только поверхности интегрированной платформы. При выборе перманентного модификатора проводили индивидуальную оптимизацию температуры атомизации для каждого из модификаторов поверхности. Для выбора оптимальной температуры атомизации в атомизатор, модифицированный соответствующим модификатором, вводили водный стандартный раствор ионов таллия с концентрацией 10 мкг/л. Результаты представлены на рисунке 12.

Рисунок 12. Зависимость аналитического сигнала абсорбции таллия (А) от температуры атомизации при использовании различных модификаторов поверхности платформы (Rh соответствует RhCl3; Pd – Pd(NO3)2; Pt – H2PtCl6;

Ru – RuCl3). В атомизатор вводили 100 пг Tl (n = 5). Разбросы соответствуют стандартному отклонению (± Sn, пг) На рисунке 13 представлены аналитические сигналы и относительные стандартные отклонения для различных модификаторов поверхности, полученные при оптимальной температуре атомизации.

Рисунок 13. Выбор модификатора поверхности графитовой платформы при определении таллия (n = 5). Температуры атомизации Немод. - 1600С;

Pd(NO3)2 – 2350 С; H2PtCl6 – 2450С; RuCl3 - 2500С; RhCl3 - 2580C Максимальный и наиболее стабильный аналитический сигнал был получен при использовании родиевого модификатора поверхности (температура атомизации 2580С). Наибольшая эффективность родиевого модификатора, вероятно, обусловлено максимальной энергией связи аналитповерхность. Низкая энергия связи аналита с поверхностью платформы приводит к тому, что атомизация аналита происходит одновременно с фронтом подъема температуры при неполном прогреве газовой фазы атомизатора, что приводит к выносу определяемых атомов из аналитической зоны. Неравновестность происходящих процессов приводит к невоспроизводимости потерь аналита и соответственно к общему снижению воспроизводимости результатов анализа. Таким образом, даже применение платформы, как и в случае атомизации бериллия из формы оксида (раздел 3.1), не обеспечивает достаточной температурной изотермичности при атомизации таллия. Использование эффективной модификации приводит к лучшему удерживанию аналита на платформе и более изотермической атомизации, значительно улучшая воспроизводимость, Sr (n = 5) уменьшается с 15 % до 3%, и увеличивая чувствительность анализа почти на 60%.

Для таллия характерна достаточно низкая величина токсической концентрации в крови. Поэтому возможно использовать только минимальное разбавление проб.

Изучение влияния хлорида на аналитический сигнал абсорбции таллия на модельных растворах показало, что наблюдается значительное занижение сигнала абсорбции таллия за счет потерь аналита еще на стадии пиролиза. На рисунке 14 представлены зависимости аналитического сигнала абсорбции таллия от температуры пиролиза при отсутствии хлорида и для раствора, содержащего 0,2 масс. % NaCl. Для оптимизации температуры пиролиза использовали стандартный раствор ионов таллия (I) с концентрацией 10 мкг/л. Аналитический сигнал абсорбции таллия измеряли, варьируя температуру пиролиза в диапазоне от 200 до 600С с шагом увеличения 50С (рисунок 14).

Рисунок 14. Зависимость измеряемого абсолютного содержания Tl от температуры пиролиза в отсутствие хлорид иона (Tl) и в присутствие 0,2 масс. % NaCl (Tl + Cl). Время пиролиза 20 секунд, модификатор поверхности платформы RhCl3. В атомизатор вводили 100 пг Tl (n = 5). Разбросы соответствуют стандартному отклонению (± Sn, пг) Как следует из полученной зависимости, присутствие в пробе хлоридов снижает максимально возможную температуру пиролиза, по крайней мере, на 150С. Таким образом, в качестве оптимальной температуры пиролиза при определении таллия в крови была выбрана температура 450С. Поскольку максимально возможная температура пиролиза сравнительно невелика, использовали модификатор окисления раствор Pd(NO3)2 с концентрацией 1 г/л [248].

Для преодоления мешающего влияния хлоридов при определении таллия в литературе предложено несколько модификаторов матрицы [314]: H2SO4, LiNO3 [313], водный NH3, NH4NO3 [314]. Для выбора наиболее эффективного модификатора проводили измерение абсорбции в модельном растворе, моделирующем пятикратно разбавленную кровь и содержащем 0.2% хлорида натрия и 10 мкг/л таллия. Результаты представлены на рисунке 15.

–  –  –

Рисунок 15. Действие различных модификаторов матрицы пробы по устранению мешающего влияния хлорид-иона. Модификатор поверхности платформы RhCl3. В атомизатор вводили 10 мкл раствора, содержащего 10 мкг/л Tl, 0,2 масс. % NaCl и 5 мкл модификатора матрицы (n = 5)

–  –  –

0.015 15 0.01 10 0.005 5

–  –  –

Рисунок 16. Выбор модификатора матрицы при определении таллия (10 мкг/л Tl, 0,2 масс. % NaCl, n = 5) Все указанные модификаторы матрицы применяли совместно с Pd(NO3)2 На основании проведенных исследований было установлено, что оптимальным модификатором матрицы является совместное применение нитрата аммония и нитрата палладия. Применение данного модификатора приводит к практически полному восстановлению сигнала абсорбции таллия и полученные результаты наиболее воспроизводимы. В дальнейшей работе при определении Tl для устранения мешающего влияния хлоридов в атомизатор вместе с пробой вводили 200 мкг нитрата аммония. Однако даже при использовании оптимальной модификации для реальных проб крови при пятикратном разбавлении характерно значительное неселективное поглощение. На рисунке 17 показан результат единичного определения таллия в реальной пробе пятикратноразбавленной крови в оптимизированных условиях, оптическая плотность неселективного поглощения превышает 1,4.

Воспроизводимость результатов анализа для n = 3 составляла 10%.

Рисунок 17. Аналитический сигнал таллия для пятикратно разбавленной пробы крови с добавкой таллия 1 мкг/л. Модификатор поверхности RhCl3, матрицы NH4NO3/Pd(NO3)2. Обозначения: 1 – сигнал общего поглощения, вторая гармоника; 2 – температура; 3 – сигнал селективного поглощения, первая гармоника; 4 – аналитический сигнал абсорбции таллия. На оси слева отложено неселективное поглощение (Анес.погл.), на оси справа температура (Т), модифицированный скиншот программного обеспечения спектрометра МГА-915МД Для улучшения воспроизводимости результатов в качестве разбавителя проб крови вместо деионизированной воды использовали 0,1% раствора Тритона Х-100. Пятикратное разбавление проб крови растворомТритона Хпривело к заметному улучшению воспроизводимости результатов анализа. Величина Sr уменьшилась на 4 % и составила 6%. Действие Тритона Х-100, вероятно, обусловлено его более выраженным лизирующим действием на форменные элементы клеток по сравнению с водой, а также изменением вязкости, поверхностного натяжения и смачивающей способности пробы, что приводит к ее более воспроизводимому дозированию на платформу (капля более равномерно растекается по поверхности платформы) и лучшему смешиванию с раствором модификатора.

Как уже было отмечено выше, разработка методики прямого определения таллия в крови потребовала очень тщательной оптимизации условий определения в силу значительных спектральных помех (рисунок 17) и физико-химических влияний (рисунок 14). Однако применение ЗМПС и многопараметрической оптимизации условий анализа позволили успешно решить данную задачу. Рисунок иллюстрирует зависимость относительного аналитического сигнала (отношение измеренного сигнала к максимальному, полученному в оптимизированных условиях) от температур атомизации и пиролиза при использовании RhCl3 и традиционного Pd(NO3)2 модификаторов поверхности интегрированной платформы Львова.

Рисунок 18. Многопараметрическая оптимизации при разработке методики прямого определения таллия в крови. Зависимость относительного аналитического сигнала (от максимального при оптимизированных условиях) от применяемых модификаторов поверхности (Rh – RhCl3; Pd – Pd(NO3)2), температуры атомизации и пиролиза Из данных рисунка 18 видно, что применение модификации поверхности солями родия обеспечивает не только более высокую чувствительность анализа (большая величина сигнала абсорбции таллия), но и лучшую устойчивость аналитического сигнала – меньшее изменение его величины при варьировании условий температурно-временной программы.

Оптимальные параметры определения таллия представлены в таблице 18.

–  –  –

После оптимизации всех этапов анализа провели оценку правильности с использованием стандартного образца состава крови Seronorm™ Trace Elements Whole Blood L-3. Измеренное значение концентрации таллия в стандартном образце составило 31,2 ± 1,0 мкг/л при сертифицированном значении 30,9 ± 1,6 мкг/л. Для валидации во всем динамическом диапазоне использовали также метод стандартных добавок. Была проведена оценка основные характеристики разработанной методики, они представлены в таблице 19.

–  –  –

Примечание – * – Предел обнаружения оценен по 3 критерию (n = 10) ** – нижняя граница соответствует пределу определения (10, n = 10) с учетом разбавления крови *** – соответствует середине динамического диапазона В таблице представлено сравнение пределов обнаружения, используемой процедуры подготовки пробы для разработанной методики определения таллия с имеющимися литературными данными.

–  –  –

Разработанная методика обладает значительно лучшими ПО по сравнению с ранее опубликованными данными по ААС определению таллия в крови. Методика позволяет определять токсические и субтоксические концентрации таллия в крови человека.

3.4 ПРЯМОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РТУТИ В КРОВИ

3.4.1 Непосредственный ввод пробы крови в атомизатор Для создания методики прямого определения ртути в крови человека методом ААС-ЭТА с ЗМПС использовали прямое введение разбавленной пробы крови в атомизатор Массмана. Были оптимизированы параметры ТВП, модификаторы поверхности и матрицы пробы крови, степень разбавления проб крови. Оптимизацию ТВП осуществляли и для печей Массмана без платформы и для печей с интегрированной платформой Львова.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«А.П.Кузнецов, С.П.Кузнецов, Л.А.Мельников ФИЗИЧЕСКИЕ ЗАДАЧИ для научных работников младшего возраста Учебное пособие ИЗДАТЕЛЬСТВО САРАТОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА УДК 53(076.1+079.1) ББК 22.3я73 К89 Кузнецов А.П., Кузнецов С.П., Мельников Л.А.К89 Физические задачи для н...»

«Лекция 10 1. Естественный отбор минеральных видов или почему их так мало относительно неорганических соединений 2. Реальные кристаллы Природа выбирает лишь простейшие пути и простейшие соединения (А.Е.Ферсман) Среди более 13 млн известных сейчас химических соединений неорганические составляют несколько сот тысяч. Рентгеноструктурное...»

«Введение в математическую логику (oсень 2016) В.Б. Шехтман Лекция 1 Высказывания это предложения естественного языка. Естественные языки – предмет изучения других наук: лингвистики и филологии. В математической логике рассматриваются формальные языки. Простейший из них язык классической...»

«Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Физико-химические исследования _ Подраздел: Коллоидная химия Регистрационный код публикации: р3 Поступила в редакцию 19 июня 2002 г.; УДК 541.182.213.621.928.95 ИССЛЕ...»

«82 Вопросы геофизики. Выпуск 44. СПб., 2011 (Ученые записки СПбГУ; № 444) А. В. Пономаренко, Б. М. Каштан ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ УПРУГИХ ВОЛН С ТРЕХМЕРНЫМ НЕЛИНЕЙНО-УПРУГИМ ОБЪЕКТОМ Введение Одной из главных прикладных задач сейсмических исследований является поиск и оконтуривание объемов среды, которая может...»

«Известия НАН Армении, Физика, т.45, №2, с.133-141 (2010) УДК 541.64 ПЕРЕХОД СПИРАЛЬ–КЛУБОК БИОПОЛИМЕРОВ В РАСТВОРИТЕЛЯХ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ КОНКУРЕНТНЫМ И НЕКОНКУРЕНТНЫМ СПОСОБАМИ Ш.А. ТОНОЯН, А.С. МИРЗАХАНЯН, Г.Н. АЙРАПЕТЯН, А.В. ЦАРУКЯН, В.Ф. МОРОЗОВ Ереван...»

«Математическая модель и методы верификации программных систем А. М. Миронов, Д. Ю. Жуков В статье вводится новая математическая модель программных систем, и рассматривается проблема их формальной верификации. Предлагаются методы редукции анализируемых систем. Изложенные п...»

«Л. 1. УКАЗЪ П етр а В е л и к а г о о т ъ 14 Я нваря 1 7 0 1 г. „Великій Государь, Царь и Великій Князь П ЕТРЪ АЛЕК­ СЕВИЧЪ указалъ Именнымъ Своимъ повелніемъ въ Государств Своея Державы, на славу Всеслав­ наго Имени Всемудрйшаго Бога и Своего Царствовані я, во избаву же и по...»

«Петрология, геохимия, геохронология формы. Состав Cpx в структурах микроспинифекс отвечает авгиту Wo45-47En33-42Fs12-21. Хромшпинелид субферриалюмохромит (Cr2O3 от 42 до 46 мас.%.) присутствует в виде единичных мелких зерен. Плагиоклаз (An62-64) встречается лишь в полнокристаллических долерита...»

«ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Статус документа Элективный курс "Практикум по математике" соответствует целям и задачам обучения в старшей школе. Основная функция данного элективного курса – дополнительная подготовка учащихся 10-11 классов к государственной итоговой аттестации в форме ЕГЭ, к п...»

«База нормативной документации: www.complexdoc.ru ГОСТ Р 22.0.03-95 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БЕЗОПАСНОСТЬ В ЧРЕЗВЫЧАЙНЫХ СИТУАЦИЯХ ПРИРОДНЫЕ ЧРЕЗВЫЧАЙНЫЕ СИТУАЦИИ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОССТАНДАРТ РОССИИ Мо...»

«УДК 541.124 О природе ведущей реакции при горении энергетических материалов по газофазной модели В.П. Синдицкий Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Миусская пл., 9,...»

«: Контрольный экземпляр АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ UZ0602942 Р-8-669 Ташметов М.Ю. УДК 539.27 НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕПЛОЕМКОСТИ В КАРБИДАХ ТИТАНА Ташкен...»

«Министерство образования Республики Беларусь Учебно-методическое объединение по химико-технологическому образованию УТВЕРЖДЕНА Министерством образования Республики Беларусь 25 июля 2012 года Регистрационный № ТДI. 913/т...»

«УДК 542.87:661.882+66.094.2 А.А. ФЕДОРЕНКО, аспирант, Е.Д. ПЕРШИНА, канд. хим. наук, А.М. ФЕДОРЕНКО, докт. хим. наук, ТНУ, г. Симферополь ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ ТЕХНОЛОГИИ ЭЛЕК...»

«Белорусский государственный университет УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе А.Л.Толстик (дата утверждения) Регистрационный № УД-/баз. БИОЭНЕРГЕТИКА Учебная программа для студентов специальности 1-31 05 01 Химия 31 05 01-03 фа...»

«IV Всероссийская научно-практическая конференция "Научная инициатива иностранных студентов и аспирантов российских вузов" трудности, Гурген стал очень много времени проводить за изучением явлений в этой области, общался на эту тему...»

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙУНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА РАДИАЦИОННОЙ ХИМИИ И ХИМИКОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ УТВЕРЖДАЮ Декан химического факультета Д.В.Свиридов ""2012 г."БИОХИМИЯ ИНФОРМАЦИОННЫХ МАКРОМОЛЕКУЛ" Учебная программа для студентов специальности 1-31 05 01 Химия 31 05 01-03 фармацевтическая деятельность спец...»

«"Евразийский химический рынок". Журнал N9(45) сентябрь 2008 Производственно-практический научно-популярный журнал №9(45) Сентябрь 2008 Содержание Издается с января 2005 года Выходит один раз в месяц Учредитель ООО "Евразийский и из...»

«Дата последней редакции APRIL 2013 Редакция 7 ПАСПОРТА БЕЗОПАСНОСТИ ВЕЩЕСТВ И МАТЕРИАЛОВ Многоцелевая смазка 1 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ И СВЕДЕНИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ ИЛИ ПОСТАВЩИКЕ 1.1. Идентификация продукта Многоцелевая смазка Наименование продукта MPG, EMPG50T,...»

«Министеpство общего и пpофессионального обpазования Российской Федеpации Челябинский госудаpственный унивеpситет Г.А. Свиpидюк Г.А. Кузнецов Математический анализ II Учебное пособие Челябинск 1999 Содеpжан...»

«МАКАРОВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ АКУСТИЧЕСКАЯ ВОЛНОВАЯ КОРРЕЛЯЦИЯ ЭЛЕМЕНТАРНЫХ ДЕФОРМАЦИОННЫХ АКТОВ ПРИ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ДЕФОРМАЦИИ МЕТАЛЛОВ И СПЛАВОВ Специальность 01.04.07 – Физика конденсированного состояния Диссертация на...»








 
2017 www.kniga.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.