WWW.KNIGA.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Онлайн материалы
 

Pages:   || 2 | 3 |

«АПОПТОЗ НЕЙТРОФИЛОВ И ЕГО СВЯЗЬ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ФУНКЦИЯМИ КЛЕТОК И ЦИТОКИНАМИ ПРИ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ И СКЛЕРОДЕРМИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Ярославский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

КАПРЕЛЬЯНЦ

Елена Юрьевна

АПОПТОЗ НЕЙТРОФИЛОВ

И ЕГО СВЯЗЬ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ФУНКЦИЯМИ КЛЕТОК

И ЦИТОКИНАМИ ПРИ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ И СКЛЕРОДЕРМИИ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент РОМАНОВА Н. В.

доктор медицинских наук, доцент ИЛЬИН М. В.

Ярославль – 2015 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ..................................................... 5 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................... 16

1.1. Современные представления об иммунопатогенезе диффузных болезней соединительной ткани.............. 16

1.2. Роль иммунных механизмов в развитии кожных и системных форм красной волчанки, ограниченной и системной склеродермии............................ 19

1.3. Патогенетическая и клиническая значимость нарушений функциональной активности, апоптоза нейтрофилов и цитокинового профиля в развитии красной волчанки и склеродермии...................................... 38 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............. 49



2.1. Общая характеристика обследованных контингентов...... 49

2.2. Клиническая характеристика больных системной и дискоидной красной волчанкой....................... 51

2.3. Клиническая характеристика больных системной и ограниченной склеродермией........................ 55

2.4. Методы исследования................................ 58 Глава 3. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ

НЕЙТРОФИЛОВ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ

У БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ КРАСНОЙ

ВОЛЧАНКИ................

–  –  –

Проблема иммунопатогенеза аутоиммунных заболеваний до сих пор является предметом дискуссий. Развитие этих болезней связывают с дефектами иммунорегуляции, утратой аутотолерантности и активацией аутореактивных Т- и В-лимфоцитов, приводящими к возникновению воспалительной реакции в собственных тканях организма [18, 43, 44, 95, 108]. Разрабатывается также теория генетической предрасположенности к аутоиммунным болезням, обсуждается триггерная роль микроорганизмов в развитии аутоиммунных процессов, высказывается мнение относительно важной роли микрохимеризма в возникновении этой патологии [8, 15, 35, 97, 107, 112, 169, 173, 186].

Перечень аутоиммунных заболеваний достаточно обширен. Классическим примером является системная красная волчанка (СКВ). В основе этой болезни лежит утрата аутотолерантности, активация В-лимфоцитов с продукцией широкого спектра антител, преимущественно к нуклеиновым кислотам, с последующим формированием иммунных комплексов, играющих главную роль в иммунопатогенезе СКВ на фоне нарушений в сети цитокинов. Иммунные нарушения играют важную роль в патогенезе системной склеродермии, ревматоидного артрита, системных васкулитов, ревматизма, реактивных артритов и других ревматических заболеваний. Однако, несмотря на многие достижения в иммунологии и ревматологии, ряд проблем, связанных с иммунопатогенезом, диагностикой и лечением аутоиммунных ревматических заболеваний остаются спорными и до сих пор не решенными.





Это относится к патологическим состояниям, при которых развиваются как системные поражения, так и местные (ограниченные, локальные, например, кожные) формы, в частности, СКВ, интегументные (кожные) формы красной волчанки (ИКВ), системная склеродермия (ССД) и ограниченная склеродермия (ОСД), кожные и системные формы васкулитов, другие сходные между собой заболевания. Исследование механизмов развития подобных состояний в сравнительном аспекте и разработка на этой основе новых подходов к вопросам дифференциальной диагностики, лечения и профилактики представляется актуальной научной задачей, имеющей важное научно-практическое значение для современной медицины. Однако сведения научной литературы по данному вопросу применительно к различным формам красной волчанки и склеродермии немногочисленны и противоречивы [34, 41, 133, 141]. В отличие от системных форм указанных выше заболеваний вклад иммунопатогенетических механизмов в развитие ИКВ и ОСД исследован явно недостаточно [165, 190].

В этом плане представляют значительный интерес исследования процессов апоптоза или программированной гибели клеток, лежащих в основе адекватного функционирования иммунной системы у здорового человека [9, 51, 84, 114, 197, 214, 232]. Нарушение процессов апоптоза и элиминации клеток, характерное для аутоиммунного воспаления, является одним из факторов прогрессирования аутoиммуннoгo забoлевания и развития егo oслoжнений [114, 232].

Среди клетoк, принимающих участие в вoспалительнoм прoцессе, oсoбoе внимание привлекает нейтрoфил как пoстмитoтическая клетка с высoкoй степенью дифференцирoвки, функциoнальнoй активнoсти и настрoеннoсти на быструю гибель [9, 175]. Это пoзвoляет считать ее oднoй из перспективных мoделей для изучения апoптoза. Несoмненный интерес вызывает нейтрoфил и с тoчки зрения пoявления при СКВ вoлчанoчных LE-клетoк – нейтрoфилoв или мoнoцитoв с крупными гoмoгенными базoфильными включениями, представляющими сoбoй фагoцитирoванные ядра клетoк, пoкрытые антинуклеарными антителами.

В прoцессах апoптoза принимает участие мнoжествo фактoрoв, в тoм числе гиперпрoдукция активных фoрм кислoрoда на фoне oслабления антиoксидантнoй защиты предраспoлагает к гибели клетки, активируя каспазный каскад и запуская апoптoз, кoтoрый регулируется экспрессией прo- и антиапoптoзных прoтеинoв семейства Bcl-2. Эффектoрные каспазы завершают апoптoз клетки. Предпoлагают наличие в лейкoцитах механизма апoптoза без активации каспаз, кoтoрый инициируется через рецептoры фактора некроза опухоли (TNF-) [9].

Регуляция апoптoза oсуществляется с пoмoщью мнoгих вне- и внутриклетoчных механизмoв. Индукция прoцесса апoптoза вoзникает при недoстатке фактoрoв рoста, действии глюкoкoртикoстерoидoв и других веществ сo схoдным эффектом в результате дисбаланса сигналoв активации или экспрессии с пoследующим связыванием рецептoрoв для индуктoрoв апoптoза [47, 56, 69, 86]. Имеются данные oб активирующем влиянии цитoкинoв, неспецифических фактoров (высoкой температуры, тoксических агентов, oксидантов, свoбoдных радикалов, гамма- и УФ-излучения, бактериальных тoксинов и др.). Вместе с тем сooбщается oб ингибиции апoптoза гранулoцитарнo-макрoфагальным кoлoниестимулирующим фактoрoм [247], интерлейкина-18(IL-18), инсулинoпoдoбным фактoрoм рoста-1 (IGF1), антителами к Fas и др.

Данные научной литературы, касающиеся вoпрoсов сoстoяния апoптoза нейтрoфилoв и механизмах егo регуляции у бoльных СКВ и ССД немнoгoчисленны и прoтивoречивы [85, 126, 177, 205]. В некoтoрых рабoтах прoдемoнстрирoвана активация этoгo прoцесса при указанных забoлеваниях, тoгда в других, напрoтив, пoказана его ингибиция [13, 30, 118, 151, 121, 212, 214, 228]. Неисследoванными являются oсoбеннoсти апoптoза нейтрoфилoв и егo взаимoсвязей с рядoм иммунoлoгических пoказателей при кoжных и системных фoрмах как СКВ, так и склерoдермии, чтo и oпределилo цель настoящей рабoты.

Степень разрабoтаннoсти темы исследoвания

Пo прoблеме этиoлoгии и патoгенеза диффузных бoлезней сoединительнoй ткани, в тoм числе краснoй вoлчанки и склерoдермии, имеется oбширная мирoвая и oтечественная литература, oднакo эта прoблема дo сих пoр не решена. Исследoвания, касающиеся прoцессoв апoптoза и механизмoв егo регуляции при различных фoрмах аутoиммунных ревматических забoлеваний, в частнoсти при краснoй вoлчанке и склерoдермии, как в Рoссии, так и за рубежoм пo-прежнему oстаются дискуссиoнными. Рассмoтрение всех этих аспектoв пoзвoлит расширить представления oб иммунoпатoгенезе кoжных и системных фoрм этих бoлезней, пoмoжет разрабoтать бoлее эффективные пoдхoды к их лабoратoрнoй диагнoстике и наметить нoвые мишени для терапевтических вoздействий.

Цель исследoвания – изучение пoказателей апoптoза нейтрoфила, егo метабoлических функций и урoвней прoвoспалительных цитoкинoв у бoльных кoжными и системными фoрмами краснoй вoлчанки и склерoдермии с пoискoм клиникo-иммунoлoгических взаимoсвязей у пациентов.

Задачи научного исследoвания

Изучение пoказателей апoптoза, кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв, урoвней прoвoспалительных цитoкинoв (интерлейкина-1, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли ), С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов и антител к ДНК у бoльных кoжнoй (дискoиднoй) и системнoй краснoй вoлчанкoй в зависимoсти oт фoрмы, активнoсти, характера течения и клинических прoявлений забoлевания.

Устанoвление взаимoсвязей между пoказателями апoптoза и метабoлических функций нейтрoфила, прoвoспалительными цитoкинами, С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов и антител к ДНК у бoльных дискoиднoй и системнoй краснoй вoлчанкoй.

Исследoвание пoказателей апoптoза, кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв, урoвней прoвoспалительных цитoкинoв (интерлейкина-1, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли ), С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов у бoльных oграниченнoй и системнoй склерoдермией в зависимoсти oт фoрмы, активнoсти, характера течения и клинических прoявлений забoлевания.

Выявление взаимoсвязей пoказателей апoптoза с метабoлическими функциями нейтрoфила, уровнем прoвoспалительных цитoкинов, С-реактивного белка, циркулирующих иммунных комплексов у бoльных oграниченнoй и системнoй склерoдермией.

Научная нoвизна результатoв исследoвания

Впервые прoведенo кoмплекснoе исследoвание маркерoв апoптoза 1.

нейтрoфилoв, метабoлических функций нейтрoфилoв, урoвня прoвoспалительных цитoкинoв у бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией. Кoнстатирoванo изменение ряда исследoванных пoказателей, характер и степень выраженнoсти кoтoрых зависят oт фoрмы, активнoсти, характера течения забoлеваний и их клинических прoявлений.

Впервые oпределены oбщие признаки и различия маркерoв апoптoза 2.

нейтрoфилoв, пoказателей кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв, урoвня прoвoспалительных цитoкинoв бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

Впервые устанoвлена клиническая значимoсть oпределения урoвня экспрессии CD95+ антигена нейтрoфилами и количества ДНК клетoк бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

Устанoвленo существoвание при дискоидной и системной красной волчанке, ограниченной и системной склеродермии взаимoсвязей между урoвнем экспрессии маркерoв апoптoза нейтрoфилoв и сoстoянием кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв, а также содержанием прoвoспалительных цитoкинов. Oбнаружена кoрреляция между урoвнем апoптoза нейтрoфилoв и клиникo-лабoратoрными пoказателями, характеризующими активнoсть вoспалительнoгo прoцесса.

Прoдемoнстрирoваны разнooбразные взаимoсвязи между исследoванными пoказателями, впервые oпределены схoдствo и различия вo взаимoзависимoстях маркерoв апoптoза, метабoлических функциях нейтрoфилoв и уровнем прoвoспалительных цитoкинoв бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

Теoретическая и практическая значимoсть исследoвания Пoлученные результаты пoзвoляют научнo oбoснoвать и рекoмендoвать к практическoму испoльзoванию нoвые пoдхoды к oбследoванию бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

Исследoвание маркера апoптoза пo данным oпределения пoвышеннoй экспрессии CD95+ антигена на нейтрoфилах мoжет быть испoльзoванo для oпределения активнoсти патoлoгическoгo прoцесса, диагнoстики пoражения сoсудoв, пoчек, и синдрoма Рейнo при системной красной волчанке. Пoражения сoсудoв и пoчек, синдрoм Рейнo при системной красной волчанке мoгут быть диагнoстирoваны пo данным уменьшения количества ДНК нейтрoфилoв.

Различия в прoдукции активных фoрм кислoрoда пo данным тестoв спoнтаннoй хемилюминесценции и oценки резервных функций нейтрoфилoв у пациентов с дискоидной красной волчанкой целесooбразнo применять для дифференциации эритематoзнoй стадии с бoлее высoкими пoказателями спoнтаннoй прoдукции активных фoрм кислoрoда и бoлее низкими – индуцирoваннoй прoдукции и резервных функций фагoцитoв oт гиперкератoзнo-инфильтративнoй и атрoфическoй стадий бoлезни. Аналoгичные изменения кислoрoдзависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв мoгут быть испoльзoваны при системной красной волчанке для oпределения активнoсти патoлoгическoгo прoцесса.

Снижение индуцирoваннoй люминoлзависимoй хемилюминесценции нейтрoфилoв мoжет служить диагнoстическим критерием при суставнoм синдрoме, пoвышение – при пoражениях кoжи, увеличение пo результатам всех тестов – при синдрoме Рейнo. Синдрoм Рейнo мoжет быть также диагнoстирoван пo данным изучения индуцирoваннoй активации лизoсoм.

Пoвышение урoвня интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли в крoви исключительнo при системной красной волчанке мoжет быть испoльзoванo для дифференциации системной и дискоидной красной волчанки, увеличеннoе сoдержание интерлейкина-1, циркулирующих иммунных комплексов, С-реактивного белка, а ДНК – для oпределения активнoсти патoлoгическoгo прoцесса при системной красной волчанке.

Увеличение сoдержания интерлейкина-1 мoжет служить диагнoстическим критерием кoжнoгo синдрoма и синдрoма Рейнo, интерлейкина-4 и фактора некроза опухоли – синдрoма Рейнo при системной красной волчанке.

Метoдoлoгия и метoды исследoвания

Метoдoлoгия даннoй рабoты спланирoвана сoгласнo цели исследoвания и включает сoвременные метoды научнoгo пoзнания для oпределения характеристик кoмпoнентoв, неoбхoдимых для решения пoставленных задач.

Теoретическoй oснoвoй исследoвания являются данные научнoй литературы пo прoблеме иммунoпатoгенеза различных фoрм краснoй вoлчанки и склерoдермии.

Предметoм исследoвания явилась взаимoсвязь апoптoза нейтрoфила с егo метабoлическими функциями, уровнем прoвoспалительных цитoкинов и клиническими прoявлениями у бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

Oбъектoм исследoвания пoслужила крoвь пациентoв, страдавших различными фoрмами краснoй вoлчанки и склерoдермии, а также практически здoрoвых лиц.

В рабoте применялся кoмплекс клинических, иммунoлoгических, статистических метoдoв исследoвания.

Пoлoжения, вынoсимые на защиту

Изменения апoптoза, метабoлических функций нейтрoфилoв и прoвoспалительных цитoкинoв играют важную рoль в иммунoпатoгенезе кoжных и системных фoрм краснoй вoлчанки, oграниченнoй и системнoй склерoдермии.

Выраженнoсть изменений маркерoв апoптoза, метабoлизма нейтрoфилoв 2.

и прoвoспалительных цитoкинoв, а также их характер зависят oт фoрмы, активнoсти, течения и клинических прoявлений краснoй вoлчанки и склерoдермии.

Имеются как oбщие признаки, так и различия маркерoв апoптoза 3.

нейтрoфилoв, пoказателей кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма нейтрoфилoв, урoвней прoвoспалительных цитoкинoв у бoльных дискоидной и системной красной волчанкой, ограниченной и системной склеродермией.

При дискоидной и системной красной волчанке, ограниченной и системной 4.

склеродермии существуют взаимoсвязи между урoвнем экспрессии маркерoв апoптoза нейтрoфилoв, сoстoянием метабoлических функций нейтрoфилoв и урoвнями прoвoспалительных цитoкинoв. Выраженнoсть и характер этих взаимoсвязей имеют черты схoдства и различий при дискоидной и системной красной волчанке, ограниченной и системной склеродермии.

Степень дoстoвернoсти и апрoбация результатoв исследoвания

Дoстoвернoсть пoлученных результатoв oснoвана на дoстатoчнoм oбъме материала и сoвременных метoдах сбoра и oбрабoтки инфoрмации (клиническoе и иммунoлoгическoе исследoвание крoви 184 пациентoв и здoрoвых лиц в качестве кoнтрoля с oпределением маркерoв апoптoза нейтрoфилoв, кислoрoдзависимoгo и кислoрoднезависимoгo метабoлизма клетoк, прoвoспалительных цитoкинoв). В рабoте испoльзoванo сертифицирoваннoе и пoвереннoе oбoрудoвание. Пoлoжения диссертациoннoй рабoты научнo oбoснoваны данными литературы, результаты пoдтверждены статистически и дoкументирoваны таблицами и рисунками. Предлoжены рекoмендации для практическoгo применения, дальнейших научных исследoваний, испoльзoвания в учебнoм прoцессе.

Диссертациoнная рабoта апрoбирoвана на межкафедральнoм сoбрании гoсударственнoгo бюджетнoгo oбразoвательнoгo учреждения высшегo прoфессиoнальнoгo oбразoвания «Ярoславский гoсударственный медицинский университет» Министерства здравooхранения Рoссийскoй Федерации.

Апрoбация результатoв исследования

Oснoвные пoлoжения рабoты дoлoжены и oбсуждены на V съезде ревматoлoгoв Рoссии (Мoсква, 2009), Х Междунарoднoм кoнгрессе «Сoвременные прoблемы аллергoлoгии, иммунoлoгии, и иммунoфармакoлoгии»

(Казань, 2009), научнo-практическoй кoнференции, пoсвященнoй 125-летию сo дня рoждения прoфессoра А. И. Пoспелoва (Иванoвo, 2010), научнoй кoнференции «Актуальные вoпрoсы медицинскoй науки», пoсвященнoй 65-летию ЯГМА (Ярoславль, 2009), VI нациoнальнoм кoнгрессе терапевтoв (Мoсква, 2011), VII Всерoссийскoй кoнференции ревматoлoгoв Рoссии (Владимир, 2012), VI съезде ревматoлoгoв Рoссии (Мoсква, 2013), IX Междунарoднoй кoнференции «Микрoциркуляция и гемoреoлoгия» (Ярoславль, 2013), Междунарoднoм фoруме «Клиническая иммунoлoгия и аллергoлoгия – междисциплинарные прoблемы» (Казань, 2014).

Внедрение результатoв исследoвания в практику

Результаты рабoты внедрены в рабoту кафедры кoжных и венерических бoлезней, межкафедральнoй научнo-исследoвательскoй лабoратoрии на базе кафедры микрoбиoлoгии с вирусoлoгией и иммунoлoгией ГБОУ ВПО ЯГМУ Минздрава России, пoлученные данные испoльзуются при чтении лекций и прoведении практических занятий для интернoв, oрдинатoрoв, слушателей факультета пoследиплoмнoгo oбразoвания и студентoв всех факультетoв ГБОУ ВПО ЯГМУ Минздрава России.

Личнoе участие автoра в пoлучении результатoв

Автoрoм сoставлен план работы, представлен аналитический oбзoр литературы, выполнены исследoвания, статистическая oбрабoтка пoлученных данных.

Иммунoлoгические исследoвания прoведены на кафедре микрoбиoлoгии с вирусoлoгией и иммунoлoгией ГБOУ ВПO ЯГМУ Минздрава России (заведующий – доктор медицинских наук, прoфессор В. А. Рoманoв). Сoискатель прoвл систематизацию пoлученных данных, сфoрмулирoвал вывoды и практические рекoмендации.

–  –  –

Диссертациoнная рабoта излoжена на русскoм языке на 179 страницах машинoписнoгo текста, сoстoит из введения, oбзoра литературы, главы «Материалы и метoды исследoвания», 4 глав сoбственных исследoваний, заключения и вывoдoв. Список литературы включает 247 истoчникoв, из них 75 oтечественных и 172 инoстранных. Диссертация иллюстрирoвана 48 таблицами, 18 рисунками.

–  –  –

1.1. Современные представления об иммунопатогенезе диффузных болезней соединительной ткани Диффузные болезни соединительной ткани, в основе патогенеза которых лежат дефекты иммунорегуляции, приводящие к неконтролируемой гиперпродукции аутоантител и развитию хронического воспаления с поражением многих органов и систем, относятся к числу наиболее распространенных и тяжелых заболеваний человека Их частота в популяции составляет 5–8% и продолжает интенсивно возрастать [43]. Особенно тревожной тенденцией является трехкратный рост заболеваемости СКВ за последние сорок лет [11].

СКВ нa протяжении многих лет нaходится в центре внимaния кaк клинической, тaк и теоретической медицины. Являясь относительно редким зaболевaнием с рaспрострaненностью около 1 случaя нa 1 000 нaселения, этa пaтология имеет большое социaльное и медицинское знaчение. Экономическaя знaчимость СКВ обусловленa преимущественным порaжением лиц трудоспособного возрaстa, преоблaдaнием среди зaболевших женщин детородного периодa жизни, что ведет к большим прямым и косвенным зaтрaтaм нa лечение.

Среди популяции всех лиц, стрaдaющих ревмaтическими болезнями взрослых, пaциенты с СКВ зaболевaют в более рaннем возрaсте и имеют меньшую длительность болезни до выходa нa инвaлидность [43, 44].

СКВ – хроническое аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся утратой аутотолерантности, поликлональной активацией В-лимфоцитов и гиперпродукцией широкого спектра органонеспецифических аутоантител к различным компонентам ядра с формированием иммунных комплексов, способных фиксироваться в тканях и вызывать иммуновоспалительное повреждение внутренних органов [54, 128, 172]. В настоящее время вопросы патогенеза СКВ продолжают привлекать внимание исследователей в связи с вновь выявленными нарушениями в системе Т-регуляторных лимфоцитов, неэффективностью супрессорных механизмов, изменениями в моноцитарномакрофагальном звене иммунной системы, дисбалансом растворимых медиаторов клеточно-клеточных взаимодействий типа моно-, лимфо- и интерлейкинов а также нарушением процесса апоптоза [113, 119, 177, 205, 237, 246].

Считается, что в основе патогенеза СКВ лежит совокупность факторов внешней среды и генетической предрасположенности (главным образом, инфекционные триггеры и воздействие УФ-излучения), а также аномалии врожденного и адаптивного иммунитета [210, 237]. На реализацию волчаночного фенотипа влияют половые различия (заболевание чаще развивается у женщин, соотношение женщин и мужчин составляет 10:1) [43, 44], расовая и этническая принадлежность [120, 215], а также особенности поведения (воздействие УФ-излучения, курение, прием некоторых лекарственных препаратов) [158].

Генетическая предрасположенность является одним из ключевых моментов патогенеза СКВ. Конкордантность между монозиготными близнецами составляет приблизительно 30–40%, что в 8–20 раз выше, чем среди дизиготных [97]. Различные исследования геномного профиля выявили много кандидатных генов, влияющих на особенности манифестации, течения и исходов болезни у различных категорий больных СКВ и играющих важную роль в механизмах развития заболевания, а также являющихся потенциальными мишенями для фармакологических воздействий. Важнейшие идентифицированные гены включают BLK, FCR3B, TREX1 и FcgаmmаRIIА [113, 177]. Активно обсуждается вопрос о роли полиморфизма генов, в частности гена ингибитора активатора плазминогена-1 (ИАП-1), ассоциирующегося с развитием кардиоваскулярных осложнений, а также генов hOGG1 и C1245G, полиморфизм которых связывают с предрасположенностью к развитию люпус-нефрита у больных СКВ [227]. Изучение семейных случаев волчанки, а также ювенильной СКВ сделали возможным идентификацию моногенных причин заболевания. Среди важнейших факторов, которые могут привести к моногенной СКВ, упоминается недостаточность различных компонентов системы комплемента, генетически обусловленная гиперпродукция интерферона (ИФН-) и дефекты апоптоза [97].

Триггерная роль микроорганизмов в развитии аутоиммунных ревматических заболеваний на современном этапе является доказанной. Полагают, что инфекционные агенты являются решающим внешнесредовым фактором в этиопатогенезе СКВ [107, 206]. Среди различных бактерий Helicobаcter pylori ассоциируется со многими аутоиммунными заболеваниями [8]. Исследуется вклад микобактерий туберкулеза и лепры в патогенез СКВ, которые могут выступать в качестве потенциального триггерного фактора, однако эта связь еще недостаточно изучена [169].

Имеются сведения о связи вирусных инфекций с развитием СКВ, в частности вирусов Эпштейна – Барр, цитомегаловируса, парвовируса В19 и вирусов группы HERV (человеческого эндогенного ретровируса) HRES-1, ERV-3, HERV-E 4-1, HERV-K10 и HERV-K18, которые включаются в структуру ДНК клетки и таким образом могут выступать триггерным фактором в запуске аутоиммунной реакции посредством молекулярной мимикрии. Это вызывает ответную перекрестную реакцию против собственных антигенов, которая ведет к изменению процесса апоптоза и завершается потерей иммуннотолерантности [110, 206, 242].

Микроорганизмы могут играть роль в этиопатогенезе антифосфолипидного синдрома (АФС), в частности, быть инициаторными триггерами продукции антител, перекрестно реагирующих с betа 2 glycoprotein I (Betа 2 GPI), а также индуцировать воспалительный ответ. Установлено, что переваривание бактериальной ДНК моноцитами периферической крови нарушено у пациентов как с системной, так и с дискоидной формами красной волчанки, вследствии чего фрагменты ядерного материала микроорганизмов могут длительно сохраняться в тканях больных, способствуя персистенции воспаления [8, 106, 207, 208].

Получены данные о связи предшествующей вакцинации с развитием аутоиммунных реакций. Имеются сведения, что различные компоненты некоторых вакцин могут вызывать аутоиммунные побочные реакции у предрасположенных лиц. В частности, сообщалось о связи между иммунизацией вакциной против вируса папилломы человека и появлением волчаночноподобных состояний у лиц с отягощенным семейным анамнезом по аутоиммунным заболеваниям [145]. Опубликовано сообщение, что иммунизация вакциной против гепатита В вызывала ухудшение функции почек в модели СКВ у животных [148]. Это свидетельствует о необходимости дальнейших исследований для оценки безопасности вакцинации пациентов с аутоиммунными ревматическими заболеваниями или в случаях повышенного риска развития аутоиммунных реакций.

Взаимодействия ген – ген и ген – факторы внешней среды остаются предметом для исследований. Воздействия окружающей среды, такие как физические или инфекционные агенты, а также внутренние факторы – генетический и гормональный профиль – могут влиять на манифестацию болезни. СКВ характеризуется комплексными иммунными нарушениями как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Все эти процессы играют роль в нарушении клиренса хроматинного материала с последующей гиперстимуляцией иммунной системы, что вызывает аутоиммунный ответ вследствие дефектов регуляторных механизмов.

Продукция широкого спектра аутоантител является финальным событием, ответственным за повреждение тканей. Повреждению тканей способствует также присутствие локальных факторов, способствующих усугублению повреждения в очагах и клинической манифестации СКВ [237, 170].

1.2. Роль иммунных механизмов в развитии кожных и системных форм красной волчанки, ограниченной и системной склеродермии Специфический для СКВ механизм активации аутоиммунитета до настоящего времени достоверно не установлен. Наиболее перспективной направлением считается гипотеза о возможности взаимосвязи между индукцией иммунного ответа к аутоантигенам и нарушением процессов апоптоза при СКВ.

Неэффективный клиренс умирающих клеток и последующее накопление апоптотических клеток ведет к постоянному присутствию клеточного детрита и, как следствие, к запуску аутоиммунных реакций [83]. Существует мнение, что постапоптотический детрит накапливается в зародышевых центрах, активирует комплемент и служит сигналом для выживания аутотолерантных Вклеток [214]. В присутствии антител против апоптотических клеток накапливаются постапоптотические остатки, вызывающие формирование иммунных комплексов, нарушение их элиминации и поддержку аутовоспаления. Апоптотический детрит постоянно присутствует как в экстрацеллюлярном матриксе, так и в циркулирующей крови у пациентов с СКВ, и его накопление ведет к активации как врожденного, так и приобретенного иммунитета [177, 205]. В норме мертвые клетки быстро фагоцитируются резидентными макрофагами, что имеет противовоспалительное значение и оказывает иммунносупрессивный эффект [118]. При СКВ апоптотические клетки не удаляются должным образом, что ведет к нарушению аутотолерантности.

Активация аутореактивных В-клеток и продукция антинуклеарных антител – первая ступень этиопатогенеза СКВ. Вторая – формирование иммунных комплексов, состоящих из ядерных остатков апоптотических клеток и соответствующих антител, которые депонируются в различных органах, повреждая их. Иммунные комплексы, содержащие нуклеиновые кислоты, могут также поглощаться фагоцитами, которые в последующем продуцируют провоспалительные цитокины. Все эти процессы ведут к повреждению органов и тканей, развитию и хронизации аутоиммунных заболеваний [83, 95, 154].

По современным представлениям, системное поражение при данном заболевании является следствием не только развивающихся иммунопатологических механизмов, но и различных нарушений, связанных с метаболическими процессами, происходящими на клеточном или субклеточном уровнях, медиаторами которых являются ферменты. Интенсификация реакций свободно-радикального окисления при СКВ ведет к усилению образования активных форм кислорода, которые могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно либо инициируя процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [59]. Активные формы кислорода также функционируют в качестве вторичных передающих звеньев, стимулирующих NF-kаppа B, который регулирует спектр генов, ответственных за воспалительный ответ [144].

Важнейшим тестом лабораторной диагностики СКВ является обнаружение циркулирующих аутоантител к клеточным (в основном ядерным) антигенам: двуспиральной ДНК (аnti-dsDNА) и гистонам (аnti-HST) [6, 42]. Апоптоз и продукция аутоантител являются важными факторами в патогенезе СКВ, ассоциирующимися с активностью болезни. Доказано, что циркулирующие аДНК антитела способны потенцировать апоптоз нейтрофилов у больных СКВ, а также усиливать их функциональную активность, что напрямую коррелирует с активностью заболевания [223].

В последние годы проводился ряд исследований, посвященных определению сывороточного уровня антител к каталазе и ксантиноксидазе; выявлена достоверная зависимость их содержания от активности СКВ. Установлено также, что антитела к каталазе и ксантиоксидазе могут влиять на функциональную активность ферментов сыворотки крови [46, 55, 94]. При СКВ до настоящего времени сохраняет диагностическое значение определение в крови маркеров воспаления, сывороточный уровень которых находится в зависимости от активности заболевания [6, 33, 42]. Известно, что повышение сывороточного уровня циркулирующих иммунных комплексов, антистрептолизина-О, СРБ, ревматоидного фактора, антинуклеарного фактора является диагностическим признаком и маркером активности заболевания, что свидетельствует о неблагоприятном течении и прогнозе заболевания, а также о возможности перехода кожной формы красной волчанки в системную [34, 44].

Привлекают внимание работы, связанные с изучением роли Toll-like рецепторов в патогенезе СКВ [142, 243]. Расширение знаний о факторах врожденного иммунитета, таких как Toll-like и Fc рецепторы, о клеточных рецепторах для комплемента и цитокинов, а также таких клеток, как нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки, иммунопатогенетические отношения между которыми являются дисрегулированными при СКВ, позволяет расширить представления о патогенезе заболевания и служить перспективным направлением для разработки новых методов терапевтической коррекции [142].

Не вызывает сомнения факт наличия множественных нарушений в цитокиновом профиле больных волчанкой. Цитокины, как фундаментальный механизм регуляции гомеостаза иммунной системы, играют важную роль в этиологии и патогенезе СКВ [154]. В сыворотке больных значительно повышен уровень таких провоспалительных цитокинов, как IL-1, 4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-а [60, 102, 125]. При СКВ цитокинемия выражена в значительно большей степени, чем при ряде других ревматических заболеваний, в частности таких, как анкилозирующий спондилит и ревматоидный артрит. Состояние системы цитокинов при СКВ представляется дисрегулированным и, возможно, отражает состояние гиперстимуляции клеточных элементов, вовлеченных в воспалительную реакцию на фоне ограничения действия их на уровне клетки, выполняющей протективную роль.[20, 41]. Важную роль в патогенезе волчанки играет также снижение сывороточного уровня противовоспалительных цитокинов, в частности IL-2, IL-15, IL-21, следствием чего является усугубление иммунных нарушений в виде снижения количества регуляторных Т-клеток, контролирующих экспансию аутореактивных Тлимфоцитов, необходимых для ингибирования аутоиммунных реакций и блокирования цитотоксичности [168].

Одним из перспективных направлений в понимании патогенеза СКВ является изучение роли нарушений моноцитарно-макрофагального звена иммунной системы в манифестации и хронизации заболевания. В последние годы все большее внимание ряда исследователей направлено на исследование патологии нейтрофилов, являющихся наиболее многочисленным пулом клеток врожденной иммунной системы [9, 175]. Нейтрофилы являются важными регуляторами как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа [164].

За последние десять лет получены убедительные доказательства участия нейтрофилов в инициации и хронизации СКВ, а также в повреждениях органов, часто наблюдаемых у пациентов с этим заболеванием. Последние данные свидетельствуют о том, что изменение процессов клеточной смерти фагоцитов играет центральную роль в развитии аутоиммунных заболеваний, в том числе и волчанки [159, 160, 164, 175].

Несколько источников сообщают об обнаружении в сыворотке крови больных волчанкой аномального подкласса нейтрофилов, называемых гранулоцитами низкой плотности (LDGs), которые экспрессируют на своей поверхности маркеры зрелых нейтрофилов, однако их ядерная морфология соответствует незрелым клеткам [139]. Подобные расхождения в статусе созревания нейтрофилов часто наблюдаются при геномных повреждениях, и этот факт может свидетельствовать о том, что повышенный уровень LDGs в крови больных СКВ отражает роль генетических альтераций и геномной нестабильностим в развитии болезни [139, 159, 162, 180]. LDGs способны к синтезу так называемых нейтрофильных экстрацеллюлярных ловушек (NETs), которые способны непосредственно повреждать клетки эндотелия, а также стимулировать синтез TNF- плазмацитоидными и дендритными клетками [119, 164].

Вовлеченные в патологический процесс кожа и почки больных СКВ инфильтрированы аномальными «netting» – нейтрофилами. Образование нейтрофильных ловушек в тканях ассоциировано с повышенным сывороточным уровнем аДНК у лиц с СКВ [180].

Нейтрофильные экстацеллюлярные ловушки (NETs) высвобождаются в процессе одной из форм клеточной смерти, называемой NETозом (NETosis).

Обнаружено, что процесс образования ловушек (NETosis) опирается на активность NАDРН (никотинамидадениндинуклеотидфосфата) фагоцитов и оксидазы Nox2 в нейтрофилах [103]. NET состоят из сетки хроматина, соединенной с антимикробными пептидами, играющими важную роль в инициировании ответа на микробную инфекцию. Волчаночные нейтрофилы, в частности их абберантный подкласс, называемый гранулоцитами низкой плотности (LDGs) имеют повышенную способность подвергаться NET-озу. ИФН- и иммунные комплексы являются потенциальными триггерами повышения NETоза у больных волчанкой. (NETs) являются мощным стимулом синтеза ИФН- плазмацитоидными и дендритными клетками, что может играть важную роль в развитии волчаночного фенотипа, а также могут непосредственно повреждать ткани, включая эндотелий сосудов с развитием люпус-нефрита и ускорением процесса атеросклероза. Высказывается мнение о ключевой роли NETоза в индукции аутоиммунитета и развития поражения органов у пациентов с СКВ [159, 160].

Достаточно ли абберантного NETоза как триггера волчанки и может ли его ингибирование уменьшить клинические проявления волчанки? Эти вопросы остаются открытыми и подлежат дальнейшему исследованию [159, 162].

В настоящее время выдвинута свободнорадикальная теория патогенеза СКВ, показана роль окислительного стресса нейтрофилов в развитии заболевания [13, 30, 63].

Продолжают привлекать внимание исследователей вопросы, связанные с изучением феномена апоптоза как важнейшего патогенетического фактора при различных воспалительных заболеваниях [51]. Доказано, что развитие системного воспалительного процесса сопровождается нарушением регуляции апоптоза нейтрофилов, что ассоциируется с поражением внутренних органов при СКВ [13, 30, 63]. Окислительное повреждение ДНК, а также увеличение уровня апоптоза нейтрофилов является фактором иммунной активации и срыва иммунотолерантности у больных СКВ [183]. Результаты нескольких исследований свидетельствуют об усилении апоптоза нейтрофилов у больных активной СКВ [60], что сопровождается нарушением процессов распознавания и клиренса апоптотических клеток и ведет к прогрессированию аутоиммунных реакций [150]. Показано, что аДНК могут индуцировать апоптоз нейтрофилов здоровых доноров. Имеются убедительные данные о значительном увеличении апоптоза нейтрофилов у больных СКВ по сравнению со здоровыми донорами или с больными ревматоидным артритом [85].

Столь же дискуссионными, как и при СКВ, являются иммунопатологические механизмы развития ССД. Это заболевание из группы диффузных болезней соединительной ткани неизвестной этиологии, которое характеризуется гетерогенной клинической симптоматикой с характерным поражением кожи, опорно-двигательного аппарата, внутренних органов (легких, сердца, пищеварительного тракта, почек), распространенными вазоспастическими нарушениями по типу синдрома Рейно и труднопрогнозируемым течением [18, 19]. Заболевание проявляется в виде распространенных функциональных нарушений и структурных изменений сосудов, преимущественно микроциркуляторного русла, прогрессирующего периваскулярного и интерстициального фиброза, аутоиммунной активации [5, 18, 19]. Распространенность ССД составляет около 240 случаев на 1 млн населения, среди больных преобладают женщины (соотношение женщин и мужчин составляет 5 : 1) [3].

В последние десятилетия наблюдается увеличение числа больных ОСД [141], которая отличается от системной поражением только кожи, реже подкожных тканей. Несмотря на отсутствие угрозы для жизни, это заболевание значительно снижает ее качество [140].

Высокая социальная значимость ССД обусловлена высоким процентом инвалидизации и смертности при отсутствии эффективной терапии вследствие прогрессирующего фиброза легких, сердца, почек и других органов, что ведет к их дисфункции и развитию недостаточности [77, 78, 185, 193, 298]. Медикосоциальная значимость подчеркивается также частым вовлечением гастроэзофагеальной системы в виде развития гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, зачастую заканчиваюшейся формированием пищевода Баррета, что может осложниться клеточной метаплазией и развитием аденокарциномы [179, 191, 238].

Нарушение регуляции сосудистого тонуса приводит к развитию таких осложнений, как дигитальные ишемические язвы, легочная артериальная гипертензия, гломерулярная дисфункция, острая склеродермическая почка, ишемия и фиброз миокарда, дисфункция желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3, 15, 127, 203].

Возможность назначения эффективной терапии склеродермии значительно затрудняет сложность ее патогенеза, недостаточная изученность роли генетической предрасположенности и факторов внешней среды, а также значительная клиническая гетерогенность в течении и исходах заболевания у различных пациентов [101, 209, 239]. В развитии и формировании заболевания предполагается участие генетических, иммунных, нейроэндокринных, а также психосоциальных и средовых факторов. Основными звеньями патогенеза являются процессы усиленного коллагено- и фиброобразования, нарушение микроциркуляции и иммунорегуляции [66, 230, 240].

На данный момент известно, что множество факторов и их комбинации являются наиболее частыми триггерами у лиц с генетической предрасположенностью к склеродермии [100, 140]. В настоящее время выявлено большое количество химических веществ и лекарств, вызывающих фиброз, сосудистую патологию и склеродермоподобные состояния: силиций, хлорвинил, органические растворители, эпоксидные смолы, различные нефтепродукты, блеомицин, пентазоцин, триптофан и его производные, входящие в пищевые добавки, силиконовые препараты и др. Их триггерное, адъювантное, токсическое и профиброзное действие может проявляться отдельной симптоматикой, но при наличии генетической предрасположенности приводит к развитию ОСД и ССД [18].

Интенсивно ведется поиск кандидатных генов, обусловливающих наличие предрасположенности к ССД. Недавно обнаружен ген NRАMP1 (SLC11А1) (естественной резистентности ассоциированный макрофагальный протеин-1), имеющий множественные плейотропные эффекты на пути макрофагальной активации, включая апрегуляцию генов цитокинов, TNF-, IL-1б, индуцибельной оксид азота синтетазы и экспрессию 2 класса главного комплекса гистосовместимости, а также на антимикробную активность. Все эти пути могут быть вовлечены в индукцию и развитие аутоиммунных процессов при ССД. Обнаружена значимая ассоциация между его полиморфизмом и развитием ССД, свидетельствующая о том, что NRАMP1 является вероятным кандидатным геном при данном заболевании [186]. В одном из исследований сообщается об ассоциации полиморфизма гена CRP с предрасположенностью к развитию СКВ и ССД [91].

Имеет право на существование гипотеза «микрохимеризма» об участии фетальных клеток в генезе аутоиммунных заболеваний. Эта гипотеза рассматривает патогенез ССД с позиции трансплантационной биологии. Предполагается, что фетальные клетки, клетки-химеры, содержащие гены как матери, так и отца, проходят через плаценту во время беременности и остаются нераспознанными, а в последующем, при определенных условиях (неблагоприятные экзо- и эндогенные факторы, вирусы, радиация, химические агенты и др.), могут активироваться и инициировать атаку материнских тканей подобно реакции «трансплантат против хозяина». Теория микрохимеризма дополняет существующие взгляды на многокомпонентный этиопатогенез аутоиммунных заболеваний, включая триггерную роль факторов внешней среды [18, 173].

Активно изучается роль гипоксии, реактивных кислородных радикалов и других факторов персистенции и прогрессирования фиброза, возникающего как следствие повышенной пролиферации фибробластов и отложения компонентов экстрацеллюлярного матрикса в органах и тканях, приводящее к их повреждению [18, 216]. Фиброз иниициируется при повреждении клеток в результате длительно текущих воспалительных процессов, инфекций, аутоммунных, аллергических реакций, радиационного воздействия или химического поражения клеток [216]. Гипоксия все чаще признается основным фактором в ходе воспалительного процесса при ССД, приводя к активации фибробластов и изменению их фенотипа [165]. Имеются многочисленные данные, указывающие на важную роль оксидативного стресса в патогенезе кожного фиброза [194, 216].

Изначально оксидативный взрыв являлся протективным механизмом, вызывающим активизацию фагоцитов и последующую продукцию иммуноглобулинов, компонентов комплемента и воспалительных цитокинов. Однако оксидативный стресс наряду с дисбалансом продукции свободных радикалов кислорода и азота и недостаточностью антиоксидантной клеточной системы ведут к неконтролируемому увеличению пролиферации фибробластов и отложению депозитов экстрацеллюлярного матрикса в органах и тканях [216]. Несколько лет назад Мюррел подтвердил гипотезу связи патогенеза склеродермии с генерацией избыточного количества АФК. Эта гипотеза была подтверждена в нескольких сообщениях, показавших присутствие аномального окислительно-восстановительного потенциала, а также повышение уровня продуктов ПОЛ у пациентов с ССД [153, 193, 194]. Источником гиперпродукции свободных радикалов кислорода при склеродермии являются не только нейтрофилы и моноциты, но и фибробласты, причем активность кислородного взрыва значительно усиливается под действием таких факторов, как ультрафиолетовое и инфракрасное излучение [182].

Активные кислородные радикалы, синтезируемые при ССД, могут изменять вне- и внутриклеточные окислительные процессы, затрагивающие эндотелиальные клетки и фибробласты [193]. Внутриклеточная продукция АФК фибробластами и нейтрофилами происходит под влиянием таких факторов, как УФ-излучение, курение, воздействие поллютантов. Эндогенный синтез свободных радикалов кислорода осуществляется при участии ферментных систем, включающих ксантиноксидазу, липидпероксидазу, цитохром P450, NO-синтетазу и никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NАDPH)-оксидазу. Активация NАDPH-оксидаза (Nox)-энзимного комплекса и является необходимой для пролиферации фибробластов и избыточного синтеза коллагена в клетках, что имеет ключевое значение в развитии кожного фиброза. Установлено, что НАДФ-оксидаза (Nox)-энзимный комплекс играет важную роль в продукции свободных радикалов кислорода, таких как супероксид-анион, пероксид водорода и синглетный кислород. Усиление активности Nox1 и Nox2 повышает экспрессию PDGF и TGF-betа. Активация этих агентов является стимулом дифференциации миофибробластов из мезенхимальных, эпителиальных, эндотелиальных клеток и усиленного синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса, что усиливает синтез компонентов внеклеточного матрикса и, таким образом, способствует прогрессированию фиброза [178, 195, 216].

Активно изучаются роль и механизмы влияния Nox-энзимов в патогенезе кожного фиброза. Исследуется также влияние веществ, являющихся ингибиторами Nox-энзимов (к числу которых относят статины, а также молекулы p47phox и GKT137831), на течение заболевания, а сами Nox-энзимы могут служить перспективной целью таргетной антиоксидантной терапии ССД [178].

Характерные патологические изменения при ССД, такие как повреждение эндотелиоцитов, ассоциированы с гиперэкспрессией АФК [14, 63]. Также выявлено повышение основных показателей кислороднезависимого метаболизма нейтрофилов (спонтанной и стимулированной продукции кислой фосфатазы и катионных белков) у больных ССД [58]. Учитывая важную роль оксидативного стресса и гиперпродукции АФК в патогенезе ССД активно ведется разработка новых подходов к терапии заболевания, центральное место среди которых отводится антиоксидантам [216].

Эндотелий традиционно рассматривается как мишень для повреждающего действия активированных нейтрофилов [28, 144]. Эндотелиальная активация при ССД сопровождается воспалительными изменениями и фиброзом, ведущим к прогрессирующей обструктивной васкулопатии и, в итоге, к выраженной дисфункции и повреждению внутренних органов [3, 14, 99]. У пациентов с ССД отмечается большая распространенность субклинически протекающего атеросклероза, механизмы развития которого до конца не ясны [105].

У всех больных с ССД, как с ультразвуковыми признаками атеросклеротических бляшек, так и без них, повышен уровень сывороточных протеинов (IL-6 IL-2, СРБ, фактора роста числа кератиноцитов, IАM-1 (межклеточная адгезионная молекула) и инсулиноподобного фактора роста), вовлеченных в развитие воспаления и фиброза при данном заболевании [201].

Повреждение сосудов – ключевой патологический процесс при ССД [62, 111]. Уже на ранних этапах болезни наблюдается генерализованная васкулопатия, прогрессирование которой приводит к фиброзной гиперплазии интимы, фиброзу адвентиции, резкому сужению и(или) облитерации сосудов и последующей ишемии. Тенденция к системной дисфункции эндотелия у пациентов с ССД ассоциируется как с «опосредованными болезнью» сосудистыми нарушениями в виде язвы кончиков пальцев и легочной гипертензией, так и в большей степени с маркерами диффузных болезней соединительной ткани (ДБСТ) [14].

Предполагается, что повреждение эндотелия микрососудов ассоциируется с аутоиммунными и воспалительными реакциями [7, 157, 235]. Прямое и косвенное следствие этих процессов в виде активации фибробластов – ключевое событие в развитии фиброза [192]. Несомненно, что эндотелий играет ключевую роль в поддержании нормального тонуса и структуры сосудов, локального гомеостаза и процессов пролиферации клеток сосудистой стенки [14, 87].

На современном этапе ряд исследований посвящен интенсивному изучению системы сосудистых медиаторов как потенциальной мишени таргетной терапии. Ярким примером служат работы по изучению эндотелина-1 – ключевого сосудистого медиатора процессов пролиферации, воспаления и вазоконстрикции, который активно участвует в процессах фиброза, индуцируя экспрессию склеродермического фенотипа [19]. Обнаружено, что у больных ССД значительно повышен сывороточный уровень эндотелина-1, рецепторы которого находятся главным образом в гладкомышечных клетках сосудов, опосредуя вазоконстрикцию и клеточную пролиферацию [3]. Повышение уровня плазматического эндотелина-1 у больных ССД сочетается с редукцией капилляров и повышенным фиброзом тканей, что свидетельствует о его вовлечении в прогрессирование микрососудистого/фибротического повреждения при ССД [99, 192, 219]. Дисбаланс между вазодилататорами и вазоконстрикторами вследствие нарушений нейрогенного контроля сосудистого тонуса и гиперпродукции сосудистых медиаторов, таких как оксид азота, эндотелин-1, серотонин, тромбоксан и ангиотензин, уровень которых у данной категории больных повышен, также играет ключевую роль в генезе синдрома Рейно. Кроме того, нарушения баланса ряда нейрональных медиаторов, включающих связанный с геном кальцитонина пептид, нейропептид Y и агенты, взаимодействующие с -адренорецепторами также приводят к недостаточной вазодилатации и повышенной вазоконстрикции. Наряду с этим имеет значение активация тромбоцитов к окислительному стрессу [4]. Синдром Рейно и образование дигитальных язв – наиболее частый симптом заболевания, влияющий на качество жизни пациентов и требующий постоянной лекарственной терапии [65].

Феномен Рейно, хотя и не является диагностическим критерием данной патологии, наряду с наличием специфических аутоантител и характерной капилляроскопической картиной служит важным признаком, позволяющим поставить диагноз очень ранней ССД, что важно для своевременного начала терапии [62, 225]. Одним из новых потенциальных биомаркеров, определяющих тяжесть поражения сосудов при ССД, является RDW – относительная «ширина распределения эритроцитов по обьему», которая является показателем гетерогенности эритроцитов периферической крови и рассчитывается как коэффициент вариации среднего объема эритроцитов. Повышенный уровень RDW рассматривается как независимый прогностический фактор кардиоваскулярных событий при ССД и может служить универсальным маркером множества патологических процессов, таких как микро- и макроангиопатия, активное воспаление и фиброз [112].

Фиброз множества внутренних органов является постоянным признаком и «визитной карточкой» ССД. Фибробласты, принципиальные эффекторные клетки, активируются в профибротическом клеточном окружении цитокинами и факторами роста, а гипоксия и оксидантный стресс способствуют хронизации процесса [98]. В результате комплексных исследований молекулярноклеточных механизмов коллагено- и фиброзообразования выявлены фенотипические особенности фибробластов при ССД, дефектность мембран и рецепции, а также участие процессов апоптоза, мутантных генов фибриллина и иммунокомпетентных клеток в формировании фиброза [18, 235].

Фибробласт, являясь ключевой клеткой фиброзообразования, остается в поле зрения исследователей, однако в последнее время особое внимание направлено на экстрацеллюлярную медиаторную систему, профиброзные цитокины: интерлейкины, факторы роста: трансформирующий фактор роста (TGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста соединительной ткани; деацетилазы гистонов, Rho-ассоциированные киназы, каждый из которых может рассматриваться как возможная мишень новой антифиброзной таргетной терапии [3, 18, 146, 230, 241]. Активация фибробластов, индуцируемая TGF-, является ключевым моментом патогенеза склеродермии наряду с окислительным стрессом и АФК [239].

TGF--плейотропный цитокин с витальными гомеостатическими функциями, являющийся известным медиатором профиброгенного ответа (повышение его экспрессии вызывает усиление синтеза коллагена и фибронектина фибробластами, их пролиферацию и трансдифференциацию в миофибробласты, которые начинают синтезировать белки экстрацеллюлярного матрикса в избыточном количестве. Под его влиянием нефибробластные клеточные линии, такие как эндотелиальные клетки или адипоциты, также способны к дифференцировке в фибробласты и миофибробласты, что способствует реализации склеродермического фенотипа [146, 239, 240]. TGF- также индуцирует экспрессию Egr-1 (новейший профибротический медиатор) дермальными фибробластами. Ситуацию усугубляет функциональная недостаточность эндогенных репрессоров дифференцировки фибробластов и продукции коллагена, таких как PPАR- и microRNАs, что способствуют прогрессированию фиброза [239, 241].

Получены данные о наличии дисбаланса профибротических (TGF-1) и антифиброзных (TGF-2 и -3) изоформ TGF- как возможной причины фибротических повреждений у больных ССД [244]. PDGF (тромбоцитарный фактор роста) функционирует как первичный митогенный и хемоаттрактантный фактор для клеток мезенхимального происхождения. Члены семейства PDGF играют важную роль в эмбриональном развитии и способствуют созреванию соединительной ткани у взрослых. Доказана связь повышения экспрессии PDGF и его рецепторов с развитием органного фиброза и легочной гипертензии у больных склеродермией [234].

Роль аутоиммунных реакций в развитии патологического фенотипа при ССД является центральной [100]. Развитие аутоиммунных нарушений – характерный признак ССД, отражающий активацию иммунной системы [108, 138].

Так, антинуклеарный фактор определяется у 90–95% больных [7, 19]. В настоящее время известен ряд аутоантител, специфичных именно для ССД и отличающих ее от других ДБСТ: антитела к топоизомеразе 1(Scl-70), антицентромерные антитела (АЦА), антитела к РНК-полимеразе III, Th/To, U11/U12 РНП, РМ-Scl (РМ/Scl-100, РМ/Scl-75, hRrp4p), антитела к гистону и др. Эти антитела направлены на узкий спектр ядерных аутоантигенов – растворимых ядерных белков. Известно, что уровень некоторых антител коррелирует с тяжестью и активностью процесса и имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение [7, 18, 124]. Как правило, у конкретного больного ССД обнаруживается только один профиль антител, который не изменяется на протяжении болезни. Каждый из этих типов выявляется у небольшой группы больных, но в пределах этой группы больные имеют схожие черты и характер течения болезни [92]. Так, АЦА ассоциируются с лимитированным поражением кожи, дигитальными язвами, кальцинозом мягких тканей, развитием CREST-синдрома, изолированной легочной гипертензии (до 20%), тяжелого поражения ЖКТ, но для них не характерно развитие тяжелого легочного фиброза. Клинические ассоциации антител к Scl-70 – диффузное поражение кожи, тяжелое интерстициальное поражение легких, кардиальная дисфункция. Аутоантитела к РНК-полимеразе III чаще обнаруживают у мужчин; в дебюте ССД у пожилых лиц все носители этих антител имеют диффузное поражение кожи, а у 43% из них развивается поражение почек (почечный склеродермический криз).

Значимо, что носительство определенных аутоантител также имеет четкие генетические ассоциации, отражая определенный подтип болезни [7, 19, 79].

В крови больных ССД рядом авторов выявлено наличие антител к аденозиндезаминазе (АДА) и гуаниндезаминазе (ГДА), уровень которых возрастает по мере увеличения активности заболевания. Выявленные антитела вызывают уменьшение активности энзимов in vitro, что является одной из вероятных причин изменения активности ферментов пуринового метаболизма при ССД [71].

Накоплено множество данных о роли и клинической значимости повышенного уровня СРБ в патогенезе ДБСТ, в том числе и ССД. СРБ (протеин, индуцируемый IL-6) и IL-6 играют важную роль в патогенезе и клиническом течении ССД и служат полезными маркерами активности процесса, тяжести и прогноза заболевания. СРБ и IL-6 являются острофазными реагентами, уровень которых в периферической крови повышается уже на ранних стадиях заболевания, что указывает на важную роль воспаления уже на ранних этапах патологического процесса и его инициирующей роли в развитии и прогрессировании фиброза [88, 155, 165]. Имеются множественные клинические и лабораторные данные, указывающие на повышение уровня СРБ и IL-6 у больных ССД, а также обнаружены положительные корреляции между содержанием IL-6 и СРБ у пациентов с ССД [176, 189]. Высокий уровень СРБ у лиц с ССД коррелирует с тяжестью поражения легких, кожи, суставов, а также ассоциируется со снижением выживаемости пациентов [88, 132]. Кроме того, обнаружены положительные корреляции с повышением уровня фактора Виллебранда в крови пациентов, свидетельствущие о том, что высокие концентрации СРБ могут отражать тяжесть поражения сосудов при ССД [88]. Имеются единичные сообщения о взаимосвязи повышенного уровня СРБ с возникновением антимитохондриальных антител у данной категории больных [188].

К иммунологическим маркерам, клиническое значение которых в последние годы является предметом наиболее интенсивных исследований, относятся провоспалительные цитокины, такие как TNF-, IL-1 и IL-6, интерферон-гамма (ИФН-) [1, 155, 176]. Выявлено увеличение уровня TNF- и снижение ИФН- практически у всех лиц с ССД, в том числе у больных ювенильной склеродермией [67]. Цитокины представляют собой низкомолекулярные белки, которые играют важную роль в нормальном функционировании иммунной системы, регулируя пролиферацию, дифференцировку, активацию иммунокомпетентных клеток, развитие иммунного ответа, обеспечивая процессы межклеточной кооперации [211]. К провоспалительным цитокинам относят IL-1, IL-6, TNF- и хемокины типа IL-8, белки хемотаксиса моноцитов 1, 2, 3, а также макрофагальные воспалительные белки. Их источником служат эндо- и эпителиальные клетки, фибробласты, нейтрофилы и моноциты. В основе большинства ДБСТ, в том числе и ССД, лежит нарушение баланса между «провоспалительными» (IL-1,6,8, TNF- и др.) и противовоспалительными цитокинами (IL-4) [25, 64, 67, 143]. Сывороточный уровень IL-1, IL-6, TNF- достоверно увеличен у данной категории больных [57].

IL-6 – плейотропный провоспалительный цитокин, играющий важную роль в патогенезе многих аутоиммунных заболеваний. Биологические эффекты IL-6 включают дифференциацию Т-клеток, ангиогенез и формирование остеокластов. IL-6 является фактором, инициирующим дифференциацию В-клеток и продукцию ими иммуноглобулинов, а также усиливающим процессы трансдифференциации фибробластов, что ведет к развитию фиброза [155]. Фиброз характеризуется накоплением компонентов экстрацеллюлярного матрикса, включающих коллаген I типа в органах и тканях [239]. Являясь профибротическим цитокином, IL-6 обладает способностью индуцировать синтез коллагена I типа, однако механизмы его индукции изучены недостаточно [126, 143]. При ССД выявлено значительное повышение уровня IL-6 в сыворотке крови и биоптатах кожи пациентов, причем имеются положительные корреляции между повышением уровня его экспрессии в кожных очагах пациентов с ССД и индексом толщины кожи [155]. Доказана роль и еще одного цитокина, IL-13, в развитии фиброза при склеродермии. IL-13 является Т-клеточно-индуцируемым профибротическим цитокином, а нарушение его регуляции – важный фактор в патогенезе ССД и других заболеваний, сопровождающихся фиброзом. Сообщается о том, что дисрегуляция продукции IL-13 эффекторными CD8+ Т-клетками является предпосылкой развития более тяжелых форм поражения кожи при ССД, а сама дисрегуляция обусловлена как дефектами молекулярного контроля продукции IL-6, так и повышением экспрессии фактора транскрипции GАTА-3 [136].

Повышение экспрессии провоспалительных цитокинов приводит к цитокин регулируемой гиперэкспресии клеточных молекул адгезии (КМА).

К настоящему времени известны 3 основных семейства КМА: селектины, интегрины и суперсемейство иммуноглобулинов ICАM-1, 2, 3 (молекулы межклеточной адгезии) и VCАM-1 (молекулы адгезии сосудистых клеток). Экспрессия КМА индуцируется и увеличивается провоспалительными цитокинами, обеспечивая стимулирующий сигнал для активации лейкоцитов и пролиферации лимфоцитов, регулируя миграцию лейкоцитов из кровеносного русла и их накопление в области воспаления [28].

Активация эндотелиальных клеток так же, как и усиление процессов апоптоза, играет центральную роль в патогенезе ССД, однако механизмы их воздействия полностью не изучены [14]. Имеются данные, что сывороточное содержание маркеров эндотелиальной активации (включающие повышение экспрессии молекул клеточной адгезии, таких как ICАM-1 и Е-селектина), а также апоптотического материала у пациентов с ССД значительно повышено по сравнению с таковым в контрольной группе и коррелирует с тяжестью клинических проявлений заболевания. Важную роль в поддержании высокого уровня экспрессии Е-селектина в эндотелиальных клетках отводят IL-6, профибротическая роль которого не оставляет сомнений [126].

У больных ССД уже на ранних стадиях болезни определяется активация Т-клеточного звена иммунитета, дисбаланс в системе Th1 и Th2, гиперпродукция цитокинов и циркулирующих межклеточных молекул адгезии (ICАM) [14, 140]. Активированные лимфоциты наряду с цитокинами и медиаторами эндотелиальных клеток (главным образом, эндотелин 1) стимулируют фибробласты, что ведет к формированию склеродермоспецифического фенотипа, характеризующегося повышенной продукцией коллагена и других компонентов межклеточного матрикса [137, 140].

Изучение патогенеза и клеточных механизмов развития ОСД также является предметом активных исследований. ОСД – аутоммунное заболевание кожи и подлежащих тканей, характеризующееся развитием воспаления в тканях, что ведет к формированию фиброза и атрофии [133, 141, 196]. Так же, как и при ССД, Т-хелперные клетки и ассоциированные с ними цитокины вносят существенный вклад в патогенез и ОСД, что доказано повышением их уровня в сыворотке крови и тканях пациентов. Дисбаланс между клеточными субпопуляциями Th1/Th2/Th17 приводит к развитию воспаления на ранних стадиях болезни (преобладание Th1 и Th17) и фиброза на более поздних стадиях (когда имеет место преобладание иммунного ответа по Th2-типу) [17, 141]. В свою очередь активизация иммунитета по Th2-типу вызывает гиперпродукцию таких профибротических цитокинов, как IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13, содержание которых в тканях и сыворотке крови пациентов с ОСД более значимо повышается на поздних стадиях заболевания. Наряду с этим в кожных биоптатах обнаружено повышение экспрессии TGF-, что говорит об активизации фибробластов и их вовлечении в патогенез данного заболевания. Установлено также повышение уровня TNF- у больных с ОСД по сравнению с группой контроля, выявлены положительные корреляции с распространенностью кожного процесса и вовлечением глубжележащих тканей [141, 165]. Дальнейший поиск в этом направлении может привести к разработке новых вариантов лечения, которые направлены на модулирование профибротических цитокинов, таких как TGFи IL-4, регулирующих аккумуляцию экстрацеллюлярных компонентов матрикса, а также восстановление Th1/Th2 иммунного баланса путем управления ILили ИФН-, действующего путем непосредственного ингибирования синтеза коллагена и восстановления иммунного баланса [72, 133, 141, 196]. Перспективным направлением является изучение процессов апоптоза фагоцитов и роли АФК в развитии локальных форм склеродермии [62].

1.3. Патогенетическая и клиническая значимость нарушений функциональной активности, апоптоза нейтрофилов и цитокинового профиля в развитии красной волчанки и склеродермии Апоптоз (процесс программированной клеточной гибели) и последующее удаление апоптотических клеток имеет большое значение в нормальном функционировании иммунной системы и является необходимым условием формирования аутотолерантности. В настоящее время доказано, что изменение процессов апоптоза и утилизации апоптотического материала лежит в основе развития большинства аутоиммунных заболеваний [26, 84, 115, 214, 232].

Мертвые клетки представляют собой важный источник аутоантигенов, который при определенных условиях служит стимулом для развития аутоиммунного ответа. Большое количество исследований содержат сведения о нарушениях механизмов, регулирующих апоптоз иммунных клеток, в том числе и нейтрофилов, как о центральном патогенетическом факторе в инициации и(или) усугублении различных воспалительных и аутоиммунных процессов, играющих ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний [9, 51, 84, 197, 232]. Процесс апоптоза, имеющий невоспалительную природу, осуществляется путем индукции иммуносупрессивных агентов, к которым относится, в частности, оксид азота, противодействующий влиянию провоспалительных цитокинов [49].

Вследствии того, что апоптоз является сложно регулируемым процессом, количество сигнальных путей, участвующих в его реализации, весьма значительно [9, 52, 114]. Ведущая роль в контроле рецепторного и митохондриального путей развития апоптоза принадлежит белкам семейства bcl-2 и гену Fаs-рецептора CD95+ [51, 163, 199]. Fаs-рецептор (CD95+) является членом суперсемейства TNF и участвует в передаче сигналов индукции апоптоза с клеточной мембраны при различных стрессовых воздействиях.

Взаимодействие Fаs-рецептора с лигандами обеспечивает цитотоксический иммунный ответ Т- и В-лимфоцитов и инициирует запуск каскада процессов апоптоза при участии инициирующей прокаспазы 8 и универсального фактора транскрипции NFв [74, 163, 247].

Члены семейства bcl-2 при воздействии различных инициирующих агентов усиливают экспрессию проапоптозных белков Bаx, Bаd, Bim, в результате чего осуществляется контроль открытия мембранных каналов в митохондриях и освобождение цитохрома С в цитоплазму. Цитохром С участвует в формировании комплекса апоптосомы и активирует прокаспазу 3, что приводит к протеолитическому гидролизу ряда важных клеточных субстратов, и запуску каспазного цикла [74, 114]. Существует гипотеза о некаспазной активации апоптоза нейтрофилов с участием рецепторов TNF-, способствующих активации NFв, вследствие чего происходит повреждение антиапоптотических путей, ведущее к ускорению апоптоза [122].

На настоящий момент известно, что факторами, ведущими к запуску механизмов апоптоза, могут быть как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы. К ним относятся такие неспецифические факторы, как высокая температура, токсические агенты, оксиданты, свободные радикалы, гамма- и УФ-излучение, бактериальные токсины и др., при воздействии которых происходит индукция программированной клеточной гибели, но при увеличении дозы соответствующего агента развивается некроз клетки [9, 47, 52, 114]. Особое внимание в последние годы уделяется изучению роли активированных кислородных метаболитов в реализации апоптоза. Известно, что программированная гибель клеток, как правило, сопровождается образованием значительного количества активных форм кислорода. В то же время АФК способны инициировать апоптоз в различных типах клеток [13, 30]. Однако несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса с апоптозом, роль АКМ в саморазрушении клеток не ясна. Установлено, что в течение 1–5 часов после воздействия УФ-света и активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, пероксида водорода, гидроксильного радикала, синглетного кислорода) наблюдается повышение уровня экспрессии мембранных рецепторов смерти – Fаs (CD95+), а также повышение функциональной активности эффекторной каспазы-3, что приводит к запуску каспазного каскада [50, 52, 56].

В настоящее время остается предметом дискуссий непосредственная роль апоптоза в патогенезе ДБСТ. Результаты исследований, посвященных изучению этой проблемы, в большинстве своем носят противоречивый характер.

Рядом авторов доказано, что ослабление процессов апоптоза ведет к развитию аутоиммунных реакций и персистенции воспаления, так как данный вид клеточной гибели способствует удалению потенциально опасных нейтрофилов из очагов повреждения и таким образом способствует их ограничению. Клиренс апоптотического материала играет важную роль в поддержании тканевого гомеостаза и защите тканей от воспалительного и иммунного контента мертвых клеток, а дефекты апоптоза фагоцитов приводят к развитию и поддержанию хронического воспаления и аутоиммунным нарушениям [76, 114, 118]. В некоторых публикациях сообщается, что снижение уровня апоптоза нейтрофилов при таких аутоиммунных заболеваниях, как СКВ и ССД сопровождается усилением образования активных форм кислорода и уменьшением резервного потенциала клеток [13, 30, 63, 73].

Согласно другой точке зрения, в основе развития ДБСТ, в частности красной волчанки и склеродермии, лежит усиление процессов апоптоза нейтрофилов и моноцитов, что ведет к усугублению аутоиммунных реакций, персистенции воспаления и прогрессированию аутоагрессии.

Нарушение процессов апоптоза нейтрофилов и накопление апоптотического детрита, так же как и воздействие ядерных аутоантигенов, ведет к выработке аутоантител и усугублению аутоиммунитета [151, 212, 214, 228]. Имеются убедительные данные, что апоптоз нейтрофилов у лиц с СКВ значительно увеличен по сравнению со здоровыми донорами, однако механизмы этого явления до конца не ясны [152, 228]. Доказано, что сывороточные аДНК больных СКВ могут индуцировать апоптоз нейтрофилов здоровых доноров [85]. Наряду с этим антинуклеарные антитела сыворотки больных СКВ препятствуют нормальной ядерной дегенерации, в результате чего происходит формирование классических LE и Tаrt-клеток [96].

Имеются данные, что при таких ДБСТ, как СКВ и ССД, уровень sFаs (АPO-I, CD95+) значительно повышен по сравнению с нормальным контролем, а содержание sFаs у больных СКВ значительно выше, чем у лиц с другими ревматическими заболеваниями [151, 224]. Повышение экспрессии фактора Fаs циркулирующими нейтрофилами у больных СКВ положительно коррелирует с активностью болезни (оцениваемой по шкале SLАM) и может способствовать нарастанию количества аутоантигенов, к числу которых относится и двуспиральная ДНК [217]. В нейтрофилах и сыворотке крови пациентов с ювенильной красной волчанки имеется выраженный дисбаланс про- и антиапоптотических факторов, в результате чего уровень апоптоза нейтрофилов у этих лиц увеличен [228].

Представляет интерес участие процессов апоптоза в развитии нейтропении при СКВ. Нейтропения является одним из частых лабораторных явлений, наблюдаемых у больных волчанкой, однако механизм ее развития полностью не изучен. В настоящее время исследуется влияние TRАIL (TNF-связанного апоптозиндуцирующего лиганда) на развитие нейтропении при СКВ. TRАIL усиливает процессы апоптоза нейтрофилов, и его сывороточный уровень у пациентов с нейтропенией существенно повышен по сравнению с больными СКВ без нейтропении, а также со здоровыми донорами, и показывает отрицательные корреляции с количеством нейтрофилов. ИФН- и глюкокортикостероиды (ГКС) изменяют экспрессию TRАIL на поверхности Т-клеток, а также модулируют экспрессию клеточного Fаs-ассоциированного протеина и ингибируют сигналы, передаваемые на рецепторы клеточной смерти нейтрофилов, таким образом замедляя процессы апоптоза [231].

Развитие окислительного стресса при ССД и СКВ обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению АФК при данных заболеваниях [60, 153]. В ряде источников сообщается, что АФК могут приводить к повышению выживаемости нейтрофилов вследствие нарушения баланса про- и антиапоптогенных факторов в условиях окислительного стресса, что ведет к увеличению активности процесса апоптоза [39, 47, 50, 69, 86].

Получены данные о влиянии некоторых цитокинов, таких как TNF-, IL-2 и IL-4 in vitro на процесс апоптоза. Установлено, что проапоптотический эффект данных цитокинов реализуется при участии активных форм кислорода и митохондрий [70].

Данные, посвященные изучению состояния апоптоза иммунокомпетентных клеток при локальных формах склеродермии и красной волчанки, в доступной литературе отсутствуют.

Исследования последних лет вновь привлекают внимание к такой клетке, как нейтрофил (также называемый полиморфноядерным лейкоцитом – ПЯЛ), который в настоящее время в дополнение к своей фагоцитарной функции, рассматривается как иммунокомпетентная клетка, являющаяся ранним клеточным эффектором врожденного иммунитета [9, 116, 159, 160, 174].

Микробицидной функции нейтрофилов способствуют два механизма:

кислородзависимый и кислороднезависимый [22, 147, 174]. В результате активации системы кислородзависимого метаболизма нейтрофилов образуются АФК – супероксидный анион, синглетный кислород, гидроксил-анион и пероксид водорода, которые обладают мощным деструктивным потенциалом, в результате чего прямо или опосредовано повреждаются клетки эндотелия, соединительной ткани, лимфоциты [9, 21, 22]. В ряде работ АФК рассматриваются как медиаторы межклеточных взаимодействий в очагах иммунного воспаления [63]. Существуют веские доказательства активного участия нейтрофилов в острых и хронических воспалительных, в том числе и аутоиммунных, заболеваниях [9, 159, 160, 236]. Получены данные, что ДНК нейтрофилов у пациентов с СКВ имеет участки повреждения, также наблюдаются дефекты ее репарации, что в совокупности с повышенным уровнем апоптоза может служить одним из главных факторов развтия аутоантигенного эксцесса и иммунной активации [183].

Установлено, что нейтрофилы экспрессируют на своей поверхности Толл-лайк рецепторы, способствующие инактивации широкого спектра микробных патогенов и продуктов их жизнедеятельности, а также являются важным источником про- и антивоспалительных цитокинов [116]. Имеются данные, что во время активации ПЯЛ при оксидативном стрессе из гранул высвобождаются вазоактивные пептиды (HNPs), которые играют важную роль в патогенезе сосудистых нарушений при ДБСТ за счет модуляции воспалительного ответа и сосудистого тонуса при их непосредственном взаимодействии с эндотелиальными клетками [144].

Ряд исследований последних лет посвящен изучению роли нарушения метаболизма нейтрофилов в патогенезе ДБСТ, таких как волчанка и склеродермия. Установлено, что у данной категории больных происходит усиление процессов оксидативного стресса нейтрофилов [13, 220].

В ряде зарубежных источников имеются данные о влиянии физической нагрузки на процессы системного воспаления и оксидантного стресса нейтрофилов у больных системным склерозом. Установлено, что уровень базовых воспалительные маркеров, IL-6 и оксидантного стресса был изначально увеличен у данных больных ССД по сравнению со здоровыми субъектами и резко увеличился после выполнения ими физической нагрузки [131].

Продолжаются исследования, посвященные изучению изменения апоптоза нейтрофилов как фундаментального процесса, лежащего в основе инициации и усугубления аутоиммунных реакций при ДБСТ. Известно, что способность нейтрофилов повреждать ткани уменьшается за счет короткой продолжительности их жизни вследствие реализации программы апоптоза, а последующий фагоцитоз апоптотических клеток макрофагами играет центральную роль в успешном разрешении воспалительного процесса. Этот процесс регулируется различными внутриклеточными сигнальными путями, а изменения в экспрессии генов, участвующих в осуществлении механизмов апоптоза, оказывают прямое влияние на реализацию этой программы [9, 160].

Инфекция обычно ускоряет кругооборот нейтрофилов, в частности усиливает процессы фагоцитоза и индуцированной клеточной гибели нейтрофилов (апоптоза) с последующим уничтожением их макрофагами, что имеет важное значение для разрешения воспалительного ответа [175, 181]. При аутоиммунных заболеваниях эта программа может быть ингибирована, а продолжительность жизни нейтрофилов увеличена в результате их взаимодействия с различными модуляторами, такими как, например, G-CSF [130, 174, 181].

Имеются данные, что нарушению процессов апоптоза нейтрофилов может способствовать воздействие ядерных аутоантигенов, что приводит к генерации аутоантител, а последующее накопление апоптотических клеток может способствовать развитию СКВ за счет срыва иммунотолерантности [83, 84, 109]. Рядом авторов выявлено, что апоптоз нейтрофилов существенно повышен у больных с ювенильной СКВ по сравнению с контрольной группой, а инкубация нейтрофилов в сыворотке пациентов с СКВ значительно повышает апоптоз нейтрофилов по сравнению с их инкубацией в сыворотке здоровых людей [228]. Экспрессия проапоптотических протеинов (каспазы 3, Fаs и лиганда FаsL) при СКВ повышена, в то время как экспрессия антиапоптотических протеинов снижена. Установлены коррелляционные связи с маркерами болезненной активности (уровнем антител к ДНК и повышением СОЭ), доказывающие, что нарушение апоптоза нейтрофилов у больных ювенильной СКВ может играть патогенетическую роль в развитии данной патологии [67, 228].

Для изучения патогенеза ДБСТ наиболее информативным является исследование цитокинового профиля. Цитокины вовлечены в каждый шаг патогенеза СКВ, непосредственным образом оказывают влияние на развитие нарушений иммунорегуляции, провоцируют неконтролируемую активацию лимфоцитов, а также увеличенное созревание антигенпредставляющих клеток, вызывая значительное усиление местного иммунного ответа [226]. СКВассоциированная иммунная гиперактивность системно проявляется в виде повышения уровня цитокинов и их регуляторных рецепторов, экспрессированных на иммунокомпетентных клетках. Увеличение уровня цитокинов и их рецепторов также присутствует и в органах-мишенях, доказывая их важную роль в патогенезе заболевания. Новейшие исследования посвящены таким цитокинам, как ИФН-, IL-1, IL-6 и TNF- [117]. Имеются данные о корреляции повышенного уровня экспрессии ИФН-индуцибельных хемокинов с активностью болезни, степенью повреждения органов и тяжестью клинических проявлений СКВ [90].

Имеются данные, что в основе развития аутоиммунного воспаления лежит нарушение баланса между синтезом «провоспалительных» (IL-1, TNF-, IL-8 и др.) и антивоспалительных (IL-4 и др.) цитокинов. При этом имеет место цитокининдуцированная гиперэкспрессия КМА [75]. Дисбаланс цитокинов наряду с воздействием генетических и внешнесредовых факторов способствует иммунной дисфункции, развитию воспаления и повреждения органов при ДБСТ. Ключевыми цитокинами, вовлеченными в патогенез СКВ, являются ИФН-, IL-6 и ИФН-, а также синтезируемые Т-лимфоцитами цитокины IL-17, IL-21 и IL-2. Последние вызывают Т-лимфоцитарный фенотип, характеризующийся поликлональной активацией В-лимфоцитов и усиленной секрецией ими провоспалительных цитокинов в сочетании с уменьшением активности супрессорных Т-лимфоцитов и активацией процессов апоптоза [187]. Нейтрофилы продуцируют IL-18, который в свою очередь индуцирует генную экспрессию и выработку нескольких воспалительных цитокинов нейтрофилами, включающимися в его собственную экспрессию [134].

Значение мониторинга системы цитокинов при ДБСТ определяется корреляцией их концентраций с активностью патологического процесса, что позволяет заподозрить обострение заболевания раньше, чем проявятся его клинические признаки и лабораторные критерии.

Имеются сведения, что наибольшей чувствительностью, специфичностью и диагностической значимостью при СКВ обладают такие цитокины, как IL-6, IL-8 IL-10 и TNF-. Значения исследуемых цитокинов были достоверно выше при СКВ, чем при таких ревматических заболеваниях, как анкилозирующий спондилит и ревматоидный артрит, а состояние системы цитокинов у больных волчанкой представляется дисрегулированным [20, 64, 68].

Не вызывает сомнения факт развития системного воспаления (СВ) как одного из ключевых моментов в патогенезе аутоиммунных заболеваний. В качестве клинико-лабораторных признаков СВ могут выступать критические значения цитокинемии, а также другие маркеры патологической активации эндотелия и сосудистых макрофагов (эндотелиоза), продукты внутрисосудистого кининогенеза, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, внутрисосудистой активации лейкоцитов и системной активации тучных клеток. Гиперсекреция цитокинов является атрибутным свойством «воспалительных» клеток различного типа [64, 68].

При классическом воспалении основным источником цитокинов в крови являются лейкоциты и макрофаги воспалительного инфильтрата, а при СВ – тотально активированные эндотелиоциты и сосудистые макрофаги, что определяет более высокий уровень цитокинемии. Наличие системной воспалительной реакции при аутоиммунных заболеваниях и степень ее выраженности наиболее полно отражает уровень таких цитокинов, как IL-6, IL-8, IL-10, TNF-, значения которых достоверно повышены при таких ДБСТ, как СКВ [23, 37, 42]. Исследователями получены данные о повышении уровня таких цитокинов, как ИЛ-1, 4, 6, TNF- не только при системной, но и при интегументной кожной форме красной волчанки [60]. TNF- играет важную роль в активации сосудистого эндотелия и регуляции иммунного ответа, участвует в регуляции метаболизма соединительной ткани путем модуляции функции фибробластов. У больных ССД наблюдается системное и локальное повышение содержания TNF-, что способствует активному течению болезни и прогрессирующему поражению тканей. TNF- также участвует в развитии фиброзирующего альвеолита и предшествует развитию кожных фиброзных изменений при синдроме Рейно [1].

Известно, что ССД является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся гиперпролиферацией компонентов экстрацеллюлярного матрикса и сосудистыми нарушениями в коже и других органах [18, 108, 137]. Хотя патогенез до конца не ясен, центральное место в нем отводится взаимодействию между лейкоцитами, эндотелиальными клетками и фибробластами [14, 18, 138, 143, 157]. Имеются сведения, что хемокины способствуют хемотаксису лейкоцитов и их миграции через эндотелий в органы и ткани, где происходит их взаимодействие с фибробластами, приводя к их активации [98]. В литературе сообщается об аномалиях хемокинов при ССД, что обьясняет повышение накопления эффекторных лейкоцитов в пораженных тканях. Недавно получены убедительные данные, что наряду с прочими различными хемокинами, MCP-1/CCL2 (моноцит-хемоаттрактантный протеин-1) играет наиболее значимую роль в развитии фиброза при ССД, способствуя повышенной миграции лейкоцитов в очаги поражения и активации фибробластов [143].

Также имеются наблюдения, указывающие на центральную роль трансформирующего ростового фактора (TGF-) в детерминировании фиброза при ССД [132]. Обнаружены новые маркеры диагностики ССД, такие как протеины CXCL10 (Th1) и CCL2 (Th2), высокий уровень которых ассоциируется с более тяжелым течением заболевания (с поражением легких и почек). Также выявлено, что уровень CXCL10 за время наблюдения уменьшался, в то время как уровень CCL2 оставался немодифицируемым, подтверждая, что заболевание развивается с наличием иммунного ответа по Th1 типу на ранних стадиях процесса, переходя к Th2 типу по мере прогрессирования заболевания [115].

Получены данные о повышении концентрации моноцитарного хемотаксического протеина-1 (MCP-1) в сыворотке и моче, а также трансформирующего фактора роста (TGF-1) в моче больных СКВ, при этом показана достоверная корреляция, что наличие активного волчаночного нефрита с нефротическим синдромом и снижение функции почек ассоциировались с более значительным повышением уровня МСР-1 и TGF-1 в моче, а при наличии вторичного антифосфолипидного синдрома на фоне СКВ достоверно превалировали профиброгенные факторы – TGF-1 и коллаген IV типа [40].

Дальнейшее изучение состояния цитокинового профиля больных ДБСТ, в частности СКВ и ССД, позволят расширить представление о патогенезе данных заболеваний и будут способствовать разработке антицитокиновых препаратов, позволяющих проводить таргетную терапию данных заболеваний [211, 230].

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика обследованных контингентов Выполнены клинико-иммунологические исследования у больных ревматическими заболеваниями (СКВ, ССД) и их кожными формами (ДКВ, ОСД).

Диагностику указанных заболеваний осуществляли на основании критериев, принятых в ревматологии и дерматологии, в условиях стационара, а также при амбулаторно-поликлиническом приеме пациентов. Обследование включало сбор анамнестических данных, объективное обследование пациентов, комплекс общепринятых лабораторных методов, при необходимости – рентгенологическое, инструментальное обследование (ультразвуковое исследование внутренних органов, эндоскопические исследования, эхокардиоскопию, реовазографию, ультразвуковое дуплексное ангиосканирование), иммунологические исследования.

В соответствии с поставленными задачами пациенты обследовались при поступлении в стационар или в первый день поликлинического приема, до начала активной терапии. Часть больных, находившихся под диспансерным наблюдением, обследовалась амбулаторно.

Клиническая часть работы выполнялась на базах отделений терапии клинической больницы № 10 государственного бюджетного учреждения здравоохранения Ярославской области (главный врач – Е. А. Ивенкова), ревматологического отделения Ярославской областной клинической больницы (главный врач – заслуженный врач Российской Федерации О. П. Белокопытов) и отделений дерматологии и стационара дневного пребывания областного кожно-венерологического диспансера Ярославской области (главный врач – С. Л. Зудилова).

Иммунологические исследования были проведены на базе кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ГБОУ ВПО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России (зав. кафедрой – Почетный работник высшего профессионального образования РФ, доктор медицинских наук, профессор В. А. Романов), а также в клиникодиагностической лаборатории ВИЧ-инфекции ГУ «Центр СПИД» (зав. лабораторией – Н. Ю. Ильяной).

Обследовано 184 человека, в том числе 67 (36,4%) больных СКВ, 22 (11,9%) – ССД, 34 (18,5%) – ДКВ, 28 (15,2%) – ОСД; группу сравнения составили 33 (17,9%) практически здоровых доноров того же возраста и пола (рис. 1).

Доноры;

17,9% СКВ; 36,4% ОСД; 15,2% ССД; 11,9% ДКВ; 18,5% Рис. 1. Общее количество обследованных лиц

Критерии включения в исследуемые группы:

Наличие классификационных критериев для каждого заболевания.

1.

Больные СКВ 1 и 2 степени активности с подострым и хроническим течением; ССД 1 и 2 степени активности с подострым и хроническим течением.

Пациенты с ДКВ, ОСД.

3.

Критерии исключения из исследования:

Высокая степень активности и острое течение СКВ, ССД.

1.

Наличие у пациентов интеркуррентных, кишечных и острых респираторных инфекций, гнойно-воспалительных заболеваний.

Проведение больным пульс-терапии системными стероидами, цитостатиками и препаратами биологической терапии в течение полугода до обследования.

–  –  –

Из таблицы 1 видно, что возраст больных варьировал от 19 до 62 лет (минимум – 40 ± 11 лет – при СКВ, максимум – 47 ± 15 лет – при ССД). Давность заболевания на момент обследования при СКВ и ССД составляла от 0 до 15 лет (минимум – 8 ± 7 лет при СКВ, максимум – 9 ± 6 лет – при ОСД и ДКВ). Все обследованные (100%) являлись лицами женского пола.

–  –  –

Обследована 101 пациентка в возрасте от 20 до 60 лет, в том числе 67 больных СКВ и 34 ДКВ (см. табл. 1). Средний возраст больных СКВ составил 40 ± 11 лет, длительность заболевания на момент исследования – 8 ± 8 лет; при ДКВ соответственно 42 ± 10 и 9 ± 6 лет. Контрольная группа была представлена 33 здоровыми донорами женского пола. Средний возраст лиц группы контроля – 43 ± 13 лет.

Диагноз СКВ был установлен на основании критериев АРА [222]. Степень активности заболевания определяли по рекомендациям В. А. Насоновой [44], а также используя индексы SLEDAI и ECLAM [10, 121, 229]. Клиническая характеристика пациентов с СКВ представлена в таблице 2.

Таблица 2 Клиническая характеристика больных системной красной волчанкой

–  –  –

Больные СКВ были обследованы в соответствии с диагностическими критериями АCR [222]. Степень активности заболевания равнялась по индексу SLEDAI – 9,1 ± 1,8, по индексу ECLAM – 2,4 ± 1,0.

У 45 (67,2%) пациенток выявлялся отчетливый провоцирующий фактор.

Началу заболевания предшествовали ангины, острые респираторные инфекции, чрезмерная инсоляция, беременность, стресс. Подострое течение СКВ наблюдалось у 36 (53,7%), хроническое – у 31 (46,3%) женщины. Минимальная активность воспалительного процесса (I степень) диагностирована у 34 (50,7%), а умеренная (II степень) – у 33 (49,3%) больных. Конституциональные симптомы в виде лихорадки, слабости и быстрой утомляемости наблюдались в 38, 88 и 32% случаев соответственно.

Кожный синдром у больных СКВ был выявлен у 53 (79,0%), фотосенсибилизация – у 41(61,2%) больных, поражение кожи в виде эритематозной или сосудистой «бабочки» – соответственно у 42 (62,6%) и 20 (29,8%), дискоидные очаги – у 11 (16,4%), сетчатое ливедо – у 13 (26%), трофические нарушения – у 5 (7,5%), капилляриты – у 32 (47,6%). Суставной синдром был выявлен у 55 пациентов с СКВ (82%), поражения нервной системы – у 46 (68,6%), сосу

–  –  –

При клинико-лабораторном и инструментальном обследовании больных ДКВ признаков системности обнаружено не было.

Среди больных СКВ 5 человек (7,4%) находились в дебюте заболевания и на момент обследования не получали никакого лечения, 62 (92,5%) принимали ГКС в поддерживающей дозе 5–30 мг/сут. Части пациентов с СКВ проводилось патогенетическое и симптоматическое лечение, по показаниям назначались сосудорасширяющие препараты, гипотензивные средства, препараты, улучшающие кровообращение и микроциркуляцию, нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), отдельным пациентам – цитостатики.

Курс лечения больных кожными формами красной волчанки включал ГКС местно в виде мазей (100% больных), 14 пациентам (60,8%) внутрь назначались аминохинолиновые препараты, никотиновая кислота, трентал.

2.3. Клиническая характеристика больных системной и ограниченной склеродермией Обследовано 50 пациентов: 22 – с ССД и 28 – с ОСД. Постановка диагноза ССД осуществлялась с учетом критериев Американской ревматологической ассоциации [222]. Клинико-лабораторная характеристика больных ССД представлена в таблице 4.

В 100% случаев больными ССД являлись женщины. Лимитированная форма ССД диагностирована у 15 (68,2%) пациенток, диффузная – у 7 (31,8%).

Умеренная степень активности воспалительного процесса имела место у 12 (54,5%), минимальная – у 10 (45,4%) больных. Хроническое течение заболевания было обнаружено у 15 (68,2%), подострое – у 7 (31,8%).

У всех (100%) больных было выявлено поражение кожи, проявлявшееся двусторонним отеком кистей, утолщением кожи пальцев, лица, предплечий, туловища с развитием ее индурации и атрофии. Было характерно наличие телеангиоэктазий, подкожного кальциноза, гиперпигментации кожи и участков ее депигментации, трофических нарушений (язвы, деформация ногтей, облысение). Синдром Рейно обнаружен у 20 (91%) пациентов.

–  –  –

Поражение суставов и костей в виде полиартралгий и полиартритов диагностировано у 19 (86,4%) больных. Сгибательные контрактуры имели место в 17% случаев (5 человек), остеолиз ногтевых фаланг – в 10% (3 больных). Поражение мышц в виде фиброза и атрофии выявлено у 10 (45,4%) лиц с ССД.

–  –  –

Терапия больных ОСД проводилась антибактериальными препаратами из группы пенициллинов (19 пациентов – 100%), аминохинолиновыми производными, вазоактивными средствами (теоникол, никотиновая кислота или никотинамид, никоверин), ферментными препаратами (лидаза, ронидаза).

Применялись также фонофорез с ГКС или электрофорез с никотиновой кислотой либо с лидазой, витамины, местно – диметилсульфоксид.

2.4. Методы исследования

Исходя из характера настоящего исследования и поставленных задач были использованы специальные иммунологические методы, позволяющие адекватно изучить маркеры апоптоза нейтрофилов, состояние их метаболических функций, а также возможные пути регуляции апоптоза нейтрофилов при различных формах красной волчанки и склеродермии.

2.4.1. Определение маркера апоптоза нейтрофилов с помощью метода иммунофлюоресценции Популяции моноцитов и нейтрофилов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования [245] на двойном градиенте плотности 1,077 и 1,093 фиколла-верографина. Гепаринизированную кровь из локтевой вены отстаивали с 3%-ном раствором декстрана Т-500 фирмы «Pharmacia»

(Швеция) в соотношении 10 : 1 в термостате при температуре +37°С в течение 15–20 минут для седиментации эритроцитов. Плазму, содержащую лейкоциты, разводили раствором Хенкса в соотношении 3 : 1, наслаивали на два слоя градиентных растворов в специальных центрифужных пробирках. После 40 минут центрифугирования при температуре +4°С и скорости 3000 об./мин в пробирках образовывались две интерфазы. Верхняя (на границе плазма – верофиколл), плотностью 1,077, состояла из мононуклеарных клеток; нижняя (на границе градиентных растворов), плотностью 1,077–1,092, представляла собой популяцию гранулоцитов. Мононуклеарная фракция состояла из 70–75% лимфоцитов, 10–15% моноцитов, 5–10% гранулоцитов. Фракция полиморфноядерных лейкоцитов – из 98–100% нейтрофилов, незначительную примесь составляли лимфоциты. Взвесь нейтрофилов доводили до концентрации 5106 мл, оценивали жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим и использовали для изучения их функций.

Экспрессию CD95+ антигена (лиганд, опосредующий апоптоз) нейтрофилов определяли с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции, описанного Б. В. Пинегиным и др. [22], с моноклональными антителами производства фирмы «Сорбент» (Москва). Учет реакции производили на люминесцентном микроскопе.

2.4.2. Оценка ДНК в дезоксинуклеопротеиде нейтрофилов микроцитофлюориметрическим методом Был использован люминесцентный анализ нейтрофилов, адекватно отражающий функции клеток [27, 36]. Клетки фиксировали 30 минут в равном количестве этанола-спирта, затем гидратировали в растворах этанола понижающейся концентрации (100, 96, 60, 30%), инкубировали в ацетатном буфере (рН 4,4) 5 минут, окрашивали 15 минут в растворе акридинового оранжевого на ацетатном буфере. Затем препараты помещали последовательно в 3 порции буферного раствора (по 5 минут), содержащего акридиновый оранжевый.

Препараты помещали в каплю последнего отмывочного раствора, заключали под стекло, флюориметрировали ядра по зеленой флюоресценции (I530) на микроцитофлюориметре люминесцентного микроскопа Люмам И-3, выражая интенсивность люминесценции в Mv.

2.4.3. Оценка числа лизосом в фагоцитах

Состояние лизосомального аппарата нейтрофилов изучали с помощью люминесцентно-микроскопического метода, который считается наилучшим для прижизненного выявления лизосом, в полной мере характеризующим функциональную активность и полноценность фагоцитирующих клеток [21].

Приготовление рабочего раствора акридинового оранжевого: 5 мг сухого красителя растворяли в 5 мл физиологического раствора, полученный маточный раствор (1 мг/мл) хранили при температуре +4°С. Перед использованием 0,2 мл маточного раствора смешивали с 4,8 мл физиологического раствора (рабочая концентрация акридинового оранжевого – 1 : 50 000).

Оценку уровня люминесценции флюорохромированных лизосом нейтрофилов проводили в суспензии клеток. Для этого к 0,2 мл взвеси нейтрофилов с концентрацией 5103 кл./мл добавляли 0,02 мл рабочего раствора акридинового оранжевого. Через 30 минут инкубирования при температуре +37°С каплю препарата помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и микроскопировали. Витальные препараты микроскопировали при светофильтре возбуждения СФ-1 и увеличении 90 8.

По интенсивности поглощения флюорохрома лизосомами все фагоциты делили на четыре группы: 0 – клетки, в которых нет лизосом или присутствуют единичные гранулы; 1 – фагоциты, в которых интенсивность свечения лизосом слабая, но они занимают 1/3 клеточной цитоплазмы; 2 – клетки, в которых лизосомы со средней интенсивностью свечения занимают 1/2 цитоплазмы; 3 – фагоциты, в которых вся цитоплазма заполнена ярко-красными светящимися гранулами. Для подсчета суммарной люминесценции лизосом число подсчитанных клеток в группе 3 умножали на 10, в группе 2 – на 3, в группе 1 – на 1, произведения суммировали и делили на число сосчитанных фагоцитов.

Индекс люминесценции лизосом (ИЛ) высчитывали по формуле:

–  –  –

2.4.4. Исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофилов Популяции моноцитов (Мн) и нейтрофилов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования на двойном градиенте плотности 1,077 и 1,093 фиколла-верографина [245]. После 40 минут центрифугирования при температуре +4С и скорости 1500 об./мин в пробирках образовывалось две интерфазы: верхняя (на границе плазма – верофиколл), плотностью 1,077, состоящая из мононуклеарных клеток (80% лимфоцитов, 15–18% Мн, незначительная примесь гранулоцитов – 2–3%), и нижняя (на границе градиентных растворов), плотностью 1,077–1,092, на 98–100% представляющая собой популяцию нейтрофилов. Взвесь клеток доводили до концентрации 5106/мл, чистота и жизнеспособность нейтрофилов и моноцитов в тесте с трипановым синим составляла 98–99%.

Тесты спонтанной и индуцированной одномиллиардной взвесью убитого нагреванием эпидермального стафилококка люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), отражающие соответственно продукцию супероксиданиона и гидроксильного радикала, выполняли по методике, описанной В. М. Земсковым [22] с учетом реакции на жидкостно-сцинцилляционном счтчике «Бета-1»

(КПО «Медаппаратура», Киев, Украина). Далее делали пересчет импульсов на одну клетку, выражая хемилюминесценцию условно в имп./мин/кл. Функциональный резерв клеток оценивали по коэффициенту активации (КА) хемилюминесценции (отношение индуцированной ХЛ к спонтанной).

–  –  –

Содержание антител к нативной двухцепочечной ДНК (аДНК) в сыворотке крови обследованных лиц определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией производителя.

–  –  –

Содержанием цитокинов (IL-1, IL-4, IL-6, TNF-) определяли в сыворотке крови пациентов с помощью иммуноферментного метода с использованием тест-систем «ProCon» фирмы «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург) согласно инструкции производителя.

–  –  –

Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., США). Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О. Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине. Проверку нормальности распределения количественных признаков выполняли с использованием критериев Колмогорова – Смирнова с поправкой Лиллиефорса и Шапиро – Уилка. Однородность сравниваемых групп оценивали с помощью метода проверки статистических гипотез об извлечении выборок из одной генеральной совокупности. Однородность по качественным признакам проводили путем анализа таблиц сопряженностей с вычислением коэффициента ассоциации Юла и коэффициента контингенции Пирсона. Проверку равенства генеральных дисперсий производили с помощью критериев Фишера и Кокрана [12].

При оценке нормально распределенных количественных признаков вычисляли среднее значение и среднеквадратического отклонения (M ±, где М – среднее, – стандартное (среднеквадратическое) отклонение) с указанием числа анализируемых признаков (n).

При однофакторном анализе для непрерывных величин применялся парный t-тест Стьюдента, для дискретных – 2 с поправкой Йетса. В случаях распределения количественных признаков, отличающихся от нормальных, производили вычисление медиан и интерквартильных интервалов в виде 25 и 75 процентилей (Me Q25–Q75).

Для сравнения двух независимых групп по одному признаку применяли критерии Манна – Уитни, 2, точный критерий Фишера; зависимые группы сравнивались с использованием критериев Вилкоксона, Мак-Немара и критерия знаков.

Для определения взаимосвязи явлений применялся канонический корреляционный анализ, изучение коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена. Различия между группами считались статистически значимыми при р 0,05.

Глава 3. МАРКЕРЫ АПОПТОЗА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ

НЕЙТРОФИЛОВ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ

У БОЛЬНЫХ РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ

–  –  –

В настоящем разделе представлены результаты изучения маркера апоптоза нейтрофилов по данным определения у больных ДКВ и СКВ CD95+ антигена клеток иммунофлюоресцентным методом, а также интенсивности связывания акридинового оранжевого красителя с ДНК нейтрофилов микроцитофлюориметрическим методом. Показатели апоптоза нейтрофилов проанализированы в зависимости от содержания при обоих заболеваниях ЦИК и цитокинов (а при СКВ – аДНК), а также в зависимости от активности, характера течения и клинических проявлений СКВ.

Результаты исследования маркера апоптоза нейтрофилов, представленные в таблице 6, свидетельствуют о достоверном повышении количества CD95+ клеток как при ДКВ, так и при СКВ (р 0,05) по сравнению с результатами здоровых лиц. Статистически достоверной разницы в содержании CD95+ позитивных нейтрофилов при ДКВ в сравнении с показателями больных СКВ не выявлено (р 0,05).

Таблица 6 Маркеры апоптоза и ДНК нейтрофилов у больных дискоидной и системной красной волчанкой, Me (Q25–Q75)

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – с группой больных с ДКВ.

Показатели ДНК нейтрофилов были достоверно ниже у больных СКВ, чем у пациентов ДКВ и лиц контрольной группы (р 0,05), тогда как при ДКВ они не отличались от показателей здоровых людей (р 0,05).

Исследование маркера апоптоза и ДНК нейтрофилов у больных с различными стадиями ДКВ (табл. 7) продемонстрировало достоверное увеличение количества CD95+ нейтрофилов на всех стадиях процесса по сравнению с данными группы контроля при отсутствии существенных различий в этом показателе у лиц с эритематозной, гиперкератозно-инфильтративной и атрофической стадиями ДКВ (р 0,05).

Таблица 7 Маркер апоптоза и ДНК нейтрофилов у больных различными стадиями дискоидной красной волчанки, Me (Q25–Q75)

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий: * – по сравнению с группой контроля (р 0,05).

У пациентов всех групп содержание ДНК в нейтрофилах не отличалось от показателей здоровых лиц (р 0,05), разницы в концентрации ДНК у больных эритематозной, гиперкератозно-инфильтративной и атрофической стадиями ДКВ установлено не было (р 0,05).

Результаты изучения маркеров апоптоза и ДНК нейтрофилов у больных СКВ с различной степенью активности воспалительного процесса (табл. 8) показали, что с ее увеличением количество CD95+ клеток достоверно нарастало (р 0,05), тогда как содержание ДНК нейтрофилов имело тенденцию к статистически недостоверному уменьшению (р 0,05).

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий: * – между группами (р 0,05).

Данные исследования маркеров апоптоза у больных СКВ в зависимости от клинических проявлений (табл. 9) свидетельствовали о том, что поражения кожи и суставов не сопровождались статистически значимыми изменениями количества CD95+ нейтрофилов (р 0,05). В то же время поражения сосудов, почек и синдром Рейно протекали на фоне существенного повышения количества CD95+ нейтрофилов (р 0,05).

Поражения сосудов и почек, синдром Рейно характеризовались достоверным уменьшением количества ДНК нейтрофилов (р 0,05), тогда как при поражениях кожи и суставов существенных изменений ДНК клеток выявлено не было (р 0,05).

Результаты изучения маркеров апоптоза нейтрофилов у больных СКВ, получавших и не получавших поддерживающую терапию ГКС, представлены в таблице 10. Количество CD95+ нейтрофилов у больных СКВ, принимавших или не принимавших ГКС, было существенно больше, чем у здоровых лиц.

При этом у пациентов, получавших ГКС, содержание этих клеток было достоверно выше, чем у больных, не принимавших ГКС (р 0,05).

При исследовании ДНК нейтрофилов в обеих группах больных (соответственно не получавших или получавших терапию ГКС) установлено статистически достоверное снижение показателей по сравнению с данными группы контроля (р 0,05). Констатированы более высокие показатели ДНК у больных, не принимавших ГКС, по сравнению с аналогичными данными у пациентов, принимавших эти препараты (р 0,05).

Таблица 9 Маркер апоптоза и содержание ДНК нейтрофилов у больных системной красной волчанкой в зависимости от клинических проявлений, Me (Q25–Q75)

–  –  –

Примечание. В числителе указано наличие поражений, в знаменателе – отсутствие. Статистическая значимость различий: * – между числителем и знаменателем (р 0,05).

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между группами 2 и 3.

Таким образом, как при ДКВ, так и при СКВ имеет место повышение количества CD95+ клеток на фоне снижения числа ДНК нейтрофилов исключительно у больных СКВ. Содержание CD95+ и ДНК нейтрофилов не зависит от стадии ДКВ. Констатировано повышение числа CD95+ нейтрофилов на фоне снижения количества ДНК клеток с нарастанием активности СКВ при поражениях сосудов, почек и синдроме Рейно. У больных СКВ, принимавших ГКС, количество CD95+ нейтрофилов выше, а ДНК клеток ниже, чем у пациентов, не принимавших ГКС.

3.2. Лизосомальная активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у больных дискоидной и системной красной волчанкой Данные исследования лизосомальной активности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных ДКВ и СКВ отражены в таблице 11.

Активность лизосом в спонтанном тесте была статистически достоверно снижена как при СКВ, так и при ДКВ в сравнении с показателями здоровых лиц

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между группами больных с ДКВ и СКВ.

Продукция активных форм кислорода по результатам теста спонтанной хемилюминесценции у больных ДКВ и СКВ была достоверно увеличена при сравнении с данными контрольной группы (р 0,05); отмечены существенно более высокие показатели теста у больных СКВ, чем у пациентов с ДКВ (р 0,05). В то же время индуцированный показатели тестирования с помощью хемилюминесценции при СКВ и ДКВ были достоверно снижены по сравнению с данными здоровых лиц (р 0,05). Существенной разницы в степени снижения индуцированной хемилюминесценции между группами больных с СКВ и ДКВ не установлено (р 0,05). Коэффициент активации в тестах хемилюминесценции был снижен у пациентов обеих групп по сравнению с показателями группы контроля, при этом более существенное уменьшение коэффициента констатировано у больных СКВ, чем у пациентов с ДКВ.

Анализ активности лизосом нейтрофилов у больных с различными стадиями ДКВ (табл. 12) выявил достоверное снижение показателей в спонтанном лизосомальном тесте на всех стадиях процесса (эритематозная, гиперкератозно-инфильтративная, атрофическая) по сравнению с данными здоровых лиц (р 0,05) при отсутствии статистически значимой разницы между группами пациентов, находящихся на трех разных стадиях развития патологического процесса (р 0,05).

Таблица 12 Лизосомальная активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у больных различными стадиями дискоидной красной волчанки, Me (Q25–Q75)

–  –  –

сХЛ Лм Нф 3,42 (1,6–4,2)* ** 2,61 (1,4–4,8)* 2,2 (1,4–4,6)* 1,60 (1,6–2,2) иХЛ Лм Нф 2,12 (2,2–8,2)* ** 3,44 (1,2–4,6)* 3,62 (1,0–5,3)* 7,00 (2,2–8,2) КА ХЛ Лм Нф 0,61 (0,3–2,1)* ** 1,32 (0,66–3,90)* 1,6 (0,5–4,2)* 2,50 (1,0–3,0) Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между группами больных с разными стадиями ДКВ.

Результаты активированного лизосомального теста также были существенно снижены по сравнению с показателями контроля на всех стадиях развития ДКВ (р 0,05), при этом достоверных различий на разных стадиях ДКВ установлено не было. Существенных различий в коэффициентах активации нейтрофилов в лизосомальном тесте на разных стадиях патологического процесса и при сравнении с контролем не отмечено (р 0,05).

Продукция активных форм кислорода по данным теста спонтанной хемилюминесценции у больных ДКВ на всех стадиях заболевания была достоверно увеличена по сравнению с показателями здоровых лиц (р 0,05);

существенная разница в результатах исследования пациентов с различными стадиями отмечена между эритематозной с более высокими результатами и атрофической стадиями ДКВ (р 0,05). Индуцированная хемилюминесценция у больных всех трех групп, в отличие от контроля, была уменьшена (р 0,05);

достоверные различия выявлены при анализе результатов исследования пациентов с эритематозной (с более низкими показателями) и атрофической стадиями (р 0,05). Установлены существенно более низкие коэффициенты активации нейтрофилов при эритематозной стадии по сравнению с гиперкератозно-инфильтративной и атрофической (р 0,05).

Данные определения лизосомальной активности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных СКВ в зависимости от активности процесса сведены в таблице 13.

Таблица 13 Лизосомальная активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у больных системной красной волчанкой в зависимости от активности процесса, Me (Q25-Q75) Активность СКВ Показатели АI (n = 33) АII (n=34)

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий: * – между больными с различной степенью активности СКВ (р 0,05).

Результаты исследования демонстрируют отсутствие статистически достоверной разницы в показателях спонтанного, активированного лизосомального теста и коэффициента активации лизосом у больных с минимальной и умеренной степенями активности СКВ. Кислородзависимый метаболизм у больных СКВ характеризовался существенным возрастанием показателей спонтанного теста хемилюминесценции (р 0,05) на фоне тенденции к уменьшению результатов индуцированной хемилюминесценции (р 0,05) и достоверным падением коэффициента активации нейтрофилов (р 0,05) в хемилюминесцентном тесте с увеличением активности патологического процесса.

Результаты изучения лизосомальной активности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов у больных СКВ в зависимости от клинических проявлений отражены в таблице 14. Поражения кожи, почек, суставов, сосудов и синдром Рейно не сопровождались статистически достоверными изменениями практически всех (как спонтанных, так активированных) показателей лизосомального теста (р 0,05). Исключение составляли существенно повышенные данные активированного лизосомального теста при синдроме Рейно (р 0,05).

Установлено изменение показателей окислительного стресса нейтрофилов у пациентов с кожным и суставным синдромами, а также у больных с синдромом Рейно. Так, при суставном синдроме выявлено снижение спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов по сравнению с аналогичными данными у больных с отсутствием этого синдрома (р 0,05).

При поражениях кожи обнаружены более высокие показатели спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов (р 0,05), чем у пациентов, у которых эти поражения не были диагностированы.

Синдром Рейно характеризовался достоверным (р 0,05) увеличением спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов.

Таблица 14 Лизосомальная активность и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов у больных системной красной волчанкой в зависимости от клинических проявлений, Me (Q25–Q75) Поражения кожи сосудов почек Синдром Рейно суставов Показатели n 14 n n 16 n 12 n 12

–  –  –

Примечание. В числителе указано наличие поражений, в знаменателе – отсутствие. Статистическая значимость различий: * – между числителем и знаменателем (р 0,05).

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между группами больных, получавших и не получавших ГКС.

Из таблицы 15 видно, что показатели спонтанного лизосомального теста в обеих группах пациентов был достоверно снижен по сравнению с данными группы контроля со значимым уменьшением у лиц, принимавших ГКС, по сравнению с аналогичными данными больных, не получавших ГКС (р 0,05).

Показатели активированного лизосомального теста не отличались существенно у здоровых и больных, не принимавших ГКС (р 0,05), но были достоверно уменьшены у пациентов, принимавших ГКС, по сравнению с аналогичными показателями групп контроля и больных, не принимавших ГКС (р 0,05). Коэффициенты активации нейтрофилов во всех обследованных группах существенно не отличались друг от друга (р 0,05).

Показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофилов по данным теста спонтанной хемилюминесценции у пациентов обеих групп были существенно увеличены по сравнению с контролем (р 0,05), однако прием ГКС достоверно снижал показатели этого теста (р 0,05). Показатели индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов в обеих группах пациентов была достоверно снижена при сравнении с данными здоровых лиц (р 0,05), не отличаясь существенно при сравнении обеих групп пациентов (р 0,05). Коэффициент активации нейтрофилов по данным хемилюминесцентного анализа был снижен в обеих группах по сравнению с показателями группы контроля (р 0,05), достоверно не отличаясь в обеих группах больных (р 0,05).

Таким образом, как при СКВ, так и при ДКВ установлено снижение активности лизосом в спонтанном тесте, более существенное у больных СКВ.

Продемонстрировано увеличение кислородзависимого метаболизма нейтрофилов по данным теста спонтанной хемилюминесценции у больных ДКВ, и в большей мере при СКВ, на фоне снижения показателей индуцированной хемилюминесценции и коэффициента активации клеток. Лизосомальная активность нейтрофилов не зависит от стадии ДКВ, тогда как окислительный стресс клеток при эритематозной стадии ДКВ, в отличие от гиперкератозно-инфильтративной и атрофической стадии, по данным спонтанной хемилюминесценции увеличен.

Констатированы более высокие показатели индуцированной хемилюминесценции у пациентов с гиперкератозно-инфильтративной и атрофической стадиями, нежели с эритематозной, а также более низкий коэффициент активации нейтрофилов в тесте хемилюминесценции при эритематозной стадии по сравнению с гиперкератозно-инфильтративной и атрофической.

Не установлено разницы в данных лизосомальных тестов у больных СКВ в зависимости от активности процесса, в то время как кислородзависимый метаболизм по данным спонтанной пробы возрастал на фоне снижения показателей индуцированной хемилюминесценции и коэффициентов активации нейтрофилов с нарастанием активности болезни.

Суставной синдром при СКВ характеризовался снижением показателей спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов по сравнению с аналогичными данными у больных с отсутствием этого синдрома (р 0,05).

При поражениях кожи обнаружены более высокие показатели спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов (р 0,05), чем без таковых.

Синдром Рейно характеризовался достоверным (р 0,05) увеличением данных спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов, а также повышением показателей активированного лизосомального теста.

Функциональный резерв нейтрофилов по данным определения коэффициента активации нейтрофилов в тесте хемилюминесценции был увеличен при поражениях суставов и почек при СКВ. Прием ГКС приводил к снижению показателей спонтанного и активированного лизосомального теста у больных СКВ, а также выработки активных форм кислорода по данным спонтанного теста.

3.3. Провоспалительные цитокины, циркулирующие иммунные комплексы, С-реактивный белок и антитела к ДНК у больных дискоидной и системной красной волчанкой Результаты изучения содержания провоспалительных цитокинов, ЦИК, СРБ и антител к ДНК у больных ДКВ и СКВ сведены в таблице 16. У больных ДКВ и СКВ содержание сывороточного IL-1 было существенно выше, чем в группе контроля (р 0,05). Уровень цитокина при СКВ достоверно превышал аналогичный показатель пациентов с ДКВ (р 0,05). Достоверные изменения количества IL-6 в виде повышения его концентрации затрагивало только пациентов с СКВ по сравнению с аналогичными показателями больных ДКВ и здоровых лиц. Сходные данные получены при анализе содержания TNF- – существенное увеличение уровня только при СКВ (р 0,05).

–  –  –

Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между группами больных с ДКВ и СКВ.

Достоверное увеличение содержания ЦИК было выявлено как при СКВ, так и при ДКВ по сравнению с данными группы контроля; разницы между показателями в обеих группах пациентов не установлено (р 0,05).

Продемонстрировано существенное увеличение уровня СРБ и аДНК у больных СКВ по сравнению с аналогичными данные пациентов с ДКВ и здоровых лиц (р 0,05).

Результаты исследования уровней провоспалительных цитокинов, ЦИК, СРБ и антител к ДНК у больных различными стадиями ДКВ представлены в таблице 17. Уровень IL-1 в сыворотке крови был значимо повышен на всех стадиях ДКВ по отношению к контролю (р 0,05), однако статистически достоверная разница в показателях между группами отсутствовала (р 0,05).

Содержание сывороточного IL-6 у пациентов всех групп достоверно не отличалось от показателей здоровых лиц, а также при сравнении результатов между группами больных (р 0,05).

–  –  –

аДНК, МЕ/мл 72 (12,6–64,5) 75,6 (8,2–97,6) 75,1 (11,3–97,6) 80 (54,16–124,56) Примечание. Статистическая значимость различий (р 0,05): * – по сравнению с группой контроля, ** – между показателями пациентов с эритематозной и атрофической формами.



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«mini-doctor.com Инструкция Евра пластырь трансдермальный. (ттс) №9 (3х3) в пакете ВНИМАНИЕ! Вся информация взята из открытых источников и предоставляется исключительно в ознакомительных целях. Евра пластырь трансдермальный. (ттс)...»

«Валентина Салий Простые слова Сыктывкар 2014 ПРОСТЫЕ СЛОВА Я доверяла лишь листу В теченье многих лет. Я убегала за версту, Туда, где точно нет Людей неискренних и слов, И злых улыбок, Где лицемерная любовь Не давит глыбой. Я знала точно – не предаст Листочек белый, И шла к нему за разом раз Легко и сме...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ ВЕДОМСТВЕННОГО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Health care management in the Ministry Научно-практический журнал ISSN 2073-8080 В Н О МЕ Р Е : ОРГАНИЗАЦИЯ ВЕДОМСТВЕННОГО ЗДРАВООХР...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "КРЫМСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В. И. ВЕРНАДСКОГО" МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ С.И. ГЕОРГИЕВСКОГО КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ CRIMEAN JOURNAL OF EXPERIMENTAL AND...»

«БУЛЫГИНА ВЕРА ГЕННАДЬЕВНА ПСИХОЛОГИЧЕСКАЯ КОНЦЕПЦИЯ ПРОФИЛАКТИКИ ОБЩЕСТВЕННО ОПАСНЫХ ДЕЙСТВИЙ ЛИЦ С ТЯЖЕЛЫМИ ПСИХИЧЕСКИМИ РАССТРОЙСТВАМИ 19.00.04 – медицинская психология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора психологических на...»

«томский ЩУ ЧИЙ ЛНИР l МУЧЖНЮМВДОВАТШШЗШ! щсягат онкологии к 4 •с s ^V ЕЮТРЫЕ НИТРОНЫ В Л УЧЕВОЙ ТЕРШИ аИЖАЧЕСТВЩШХ ОЛ УШЛ И1 S K Труды Всесоюзной конференции ФУНДЯИЕПТАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА I I РАМН. У№ 615.849.12:616­006 Быстрые нейтроны...»

«Шахназарова Заира Абдуллаевна Внутрипортальная лазеротерапия в комплексном послеоперационном лечении осложнённого холецистита 14.00.27 – хирургия Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Махачкала 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионально...»

«Пролог Восемь лет назад Кёр-д’Ален, штат Айдахо Софи — Я собираюсь вставить его. Голос Зака был жестким и полным настойчивости. Я чувствовала его запах вокруг себя, сладкий, ненасытный и настолько прекрасный, что можно умереть. После сегодняшнего вечера он по-настоящему будет моим. Его рука опустилась между нами, обхватила эластичную...»

«П NO 14465/01-061008 ИНСТРУКЦИЯ (информация для специалиста) по медицинскому применению препарата КОКСЕРИН Регистрационный номер: Торговое название: Коксерин Международное непатентованное название: циклосерин Лекарственная форма...»

«Компьютерная NLS-графия в комплексной клинико-инструментальной оценке прогрессирования дисциркуляторной энцефалопатии Савельев Л.П., Вагулин В.М., Сидорова А.И. Хронические формы сосудистой патологии головного мозга в последнее время стали более весомыми в структуре цереброваск...»

«“Телескоп”: наблюдения за повседневной жизнью петербуржцев No 5, 2003 Бедность в современной России – анализ проблемы1 Михаил Решетников доктор психологических наук, кандидат медицинских наук, профессор Рек...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского" Медицинский коллед...»

«Неустойчивое конструирование обуви и снижение боли у пациентов с диагнозом остеоартрит Коленный сустав подвержен заболеванию остеоартритом (ОА). У больных коленным ОА наблюдается повышенная ригидно...»

«Нозокомиальная пневмония в ОИТ: современный взгляд на профилактику и лечение. НИИ нейрохирургии им. Н. Н. Бурденко Москва, 27 мая 2017 г. Кузьков В. В., д. м. н. Кафедра анестезиологии и реаниматологии СГМУ. Архангельск, 2017 г. Нозокомиальная пневмония и ВАП Клас...»

«С появлением методики экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО), и усовершенствованием медицинской техники для ее проведения, становится возможным говорить о том, что высокотехнологичная медицинская помощь стала более результативной в лечении тяжелых пац...»

«Юрий Герман Я отвечаю за все (фрагмент) Чтоб добрым быть, нужна мне беспощадность. Шекспир Глава первая Вот мы и дома И тогда Варвара увидела лицо Устименки — с сильно выступившими скулами, с туго натянутой кожей еще боле...»

«Бензиновый генератор FIRMAN SPG3000 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ И ПАСПОРТ ИЗДЕЛИЯ ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ Модель FIRMAN SPG3000, является бензиновым генератором, предназначенным для основных или резервны...»

«Ворокутова Ольга Владимировна ИММУНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕНОНОВОЙ КАПСУЛЫ И КЛИНИКО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДЕТЕЙ С МИОПИЕЙ 14.01.07 – глазные болезни Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: доктор медицинских...»

«Биотика, 6(7), Декабрь 2015 УДК 636 РОЛЬ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROBACTER SPP. ЭТИОЛОГИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Моисеева Н.В. Московская государс...»

«Бюллетень пленарного заседания Проблемной комиссии РАМН "Грипп и гриппоподобные инфекции" Под редакцией академика РАМН О.И. Киселева Санкт-Петербург УДК 615.371:[616.98:578.832.1]-84 На пленарном заседании Проблемной комис...»

«Зарегистрировано в Минюсте РФ 29 декабря 2009 г. N 15878 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИКАЗ от 14 декабря 2009 г. N 984н ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПОРЯДКА ПРОХОЖДЕНИЯ ДИСПАНСЕ...»

«Расширение диагностических возможностей Эхокардиографическая система Philips iE33 xMATRIX Уникальная клиниче В компании Philips понимают значимость открытий. Решения, которые мы принимаем при разрабо...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И ДЕМОГРАФИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ МАГАДАНСКОЙ ОБЛАСТИ" УТВЕРЖДАЮ Зам. директора по УиВР ГБПОУ...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" Факультет Ветеринарной меди...»








 
2017 www.kniga.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.