WWW.KNIGA.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Онлайн материалы
 

«776 УДК 577:615.31 Хроматографический анализ жирных кислот клеточных стенок бифидобактерий с различной гидрофобностью Захарова Ю.В., Сухих А.С. ГБОУ ВПО ...»

776

УДК 577:615.31

Хроматографический анализ жирных кислот

клеточных стенок бифидобактерий с различной

гидрофобностью

Захарова Ю.В., Сухих А.С.

ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, Кемерово

Поступила в редакцию 23.06.2015 г.

Жирные кислоты клеточной мембраны Bifidobacterium bifidum проанализированы методом

ГХ/МС. Экстракцию жирных кислот из бактериальных клеток с разной гидрофобностью

осуществляли смесью хлороформ : гексан. Установлено, что гидрофобность определяется разным содержанием в мембране бактерий ненасыщенных и разветвленных жирных кислот. Только у высокогидрофобных бифидобактерий обнаружили изопентадекановую (isoC15:0) и метил­ тетрадекановую (13Me-C14:0) кислоты. При средней гидрофобности установлено высокое содержание изопальмитиновой (isoС16:0) и стеариновой (С18:0) кислот. Низкогидрофобные штаммы характеризуются низким содержанием мононенасыщенных жирных кислот.

Ключевые слова: ГХ-МС, жирные кислоты, бифидобактерии, гидрофобность Chromatographic analyses of membrane fatty acid Bifidobacterium with different hydrophobicity Zakharova Yu.V., Sukhikh A.S.

Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo Bifidobacteria are representatives of normal microflora of man, they control the qualitative and quantitative composition of the community, prevent the overgrowth of opportunistic bacteria. A detailed study are required molecular mechanisms of biofilm formation on the mucous membrane, and, in fact, the initial stages of interaction of the microflora with the intestinal wall. The features of the composition of fatty acids that form the cell wall of Bifidobacterium bifidum, not studied in full. The aim of the research is to study the qualitative and quantitative composition of fatty acids of the membranes of bifidobacteria with different hydrophobicity to establishing mechanisms of the adhesive activity of microorganisms.



The study used culture Bifidobacterium bifidum, isolated from the gut of healthy children. The hydrophobicity of bifidobacteria was studed by Rosenberg et all. with modifications L-Q Wang et all. The lipid fraction extracted from the washed isotonic NaCI broth culture of bifidobacteria by extraction with a mixture of chloroform : n-hexane (1:1). The resulting extract was subjected to methylation. For this purpose, a sample volume of 1 ml was placed in a vial with a volume of 1.5 ml, the solvent was evaporated under a stream of inert gas to dryness. To the dry residue was added 500 µl of a 3% solution of H2SO4 in MeOH. The resulting solution was added internal standard (10 µg undecenoic acid (Aldrich). Then the sample was heated at 900 ° C within one hour. Further extraction was carried out with 700 µl of hexane. The volume selected hexane fraction was concentrated by Stripping of solvent to volume of 200 µl. The obtained sample containing fatty acids as methyl esters were used for the analysis. Methylated samples were analyzed on gas chromatography / mass spectrometer Agilent 7000B using the column: ZB-WAX, 30m*0.25 mm*0.25 µ m.

The sample volume was 2 µl enter without division of the flow, the flow rate of 1ml/min. For statistical analysis used the software package Statistica version 6.1.

When analyzing the amount of saturated fatty acids in strains with different hydrophobicity were observed statistically significant differences in the concentrations of the isoforms, methylated and long-chain





Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6

fatty acids, i.e., those forms that define the liquid-crystalline state of the membrane (p=0.00). It is established that isopentadecanoic acid (isoС15:0) was present only in high hydrophobic bifidobacteria. Also they have a large number of registered 13-methyl-tetradecanoic acid (me-C14:0), its content was 1.3 µg. In cultures with medium hydrophobicity such acid is not detected, low hydrophobic noted a small the content is 0.1 µg. With the medium hydrophobic of bifidobacteria were also absent 12-methyl-tetradecanoate (Мe-C14:0) and palmitic (C16:0) acids, whereas at high and discovering strains their content varied in the range of 0.3-0.4 and 11.4 µg -12,5 µg, respectively. It was found that bifidobacteria with low hydrophobic content of all unsaturated fatty acids was reduced in comparison with low hydrophobic cultures. Data of GH-MS of the analysis of fatty acids of a membrane of B. bifidum allow to predict ability of a strain to adhesion that it is necessary to consider at correction of microecological violations.

Thus, the mechanisms of changes in hydrophobicity, which plays a major role in nonspecific adhesion of bacteria, determined by the regulation of the content of unsaturated and branched fatty acids in the composition of cell walls of microorganisms.

Keywords: GC-МS, fatty acid, bifidobacterium, hydrophobicity

Введение

Бифидобактерии являются доминирующими микроорганизмами среди кишечной микрофлоры. Они контролируют качественный и количественный состав сообщества, предотвращают избыточный рост условно-патогенных бактерий.

Достигается это с помощью многочисленных механизмов, которые активно изучаются [1, 2]. Особое внимание уделяют начальным этапам взаимодействия микрофлоры со стенкой кишечника, так как нарушение формирования биопленки на слизистой, лежит в основе развития микроэкологических нарушений и здоровья человека в целом [1, 3].

Взаимодействие между микрофлорой и слизистой кишечника начинается с неспецифической адгезии. Неспецифическая адгезия (docking) обратима и обусловлена физико-химическими особенностями молекул, в том числе и гидрофобностью [4, 5]. В настоящее время гидрофобность изучается как свойство, позволяющее бактериям не только взаимодействовать с углеродсодержащими материалами, но и друг с другом, со слизистой кишечника, с иммунокомпетентными клетками. В большинстве случаев гидрофобность клетке придают жирные кислоты липидов цитоплазматической мембраны бактерий. В настоящее время насчитывают более двухсот пятидесяти бактериальных жирных кислот, тогда как у человека их в 10 раз меньше. С помощью газовой хроматографии изучен состав жирных кислот большинства микроорганизмов, определены маркеры отдельных родов и видов бактерий, т.е. исследование жирнокислотного состава бактериальных липидов осуществляют с целью идентификации и таксономии микроорганизмов, а также для диагностики инфекций и дисбиотических нарушений непосредственно по клиническому материалу [6, 7]. При этом слабо изучены вопросы влияния структуры и состава жирных кислот на биологические свойства микроорганизмов, от которых зависит стабильность микросимбиоценоза, а также длительность и глубина микроэкологических нарушений.

Цель исследования – изучение качественного и количественного состава жирных кислот мембран бифидобактерий с разной гидрофобностью для установления механизмов нарушений адгезивной активности микроорганизмов.

–  –  –

кислоты, биотина, у грамотрицательных бактерий – для синтеза липополисахаридов.

Центральную роль в синтезе жирных кислот выполняет ацилпереносящий белок (АПБ) – термостабильный белковый кофактор. Он переносит растущую ацильную цепь от одного фермента к другому и доставляет молекулы-предшественники для реакции конденсации. Ферменты синтеза жирных кислот локализованы у бактерий между цитоплазмой и внутренней стороной плазматической мембраны. Их активность определяется внешними факторами, что и обусловливает различие в путях синтеза жирных кислот [5]. В связи с этим меняется относительное содержание различных жирных кислот, длина их цепей, насыщенность.

Установлено, что у анаэробных бактерий предшественником ненасыщенных жирных кислот (С 16:1, С18:1) служит С10–АПБ, а стимулирует их образование понижение температуры и содержания кислорода (анаэробный путь синтеза). Кроме этого существует аэробный путь синтеза ненасыщенных жирных кислот из насыщенных.

Он характерен для аэробных грамположительных бактерий. У некоторых грамположительных бактерий помимо неразветвленных насыщенных жирных кислот присутствуют изо-, антеизо- и -алициклические жирные кислоты, которые придают текучесть мембране. Их синтез отличается от синтеза жирных кислот с неразветвленной цепью только использованием различных ацил-АПБ в качестве затравки для удлинения цепи и специфичностью ферментов, катализирующих конденсацию молекул. Предшественниками таких модифицированных затравок служат разветвленные экзогенные разветвленные 2-оксикислоты, короткоцепочечные карбоновые кислоты [7].

Таким образом, любые изменения в микросимбиоценозе будут обусловливать различия в путях синтеза жирных кислот у бактерий. В связи с этим актуальным является исследование жирнокислотного состава мембраны при различной гидрофобности бактерий, что позволит раскрыть некоторые механизмы развития микроэкологических нарушений.

Эксперимент

Объектом исследования были культуры Bifidobacterium bifidum, выделенные из кишечника здоровых детей. Выделение бифидобактерий проводили рутинным бактериологическим методом. Для создания анаэробных условий применяли анаэростаты (BBL, США) и газогенерирующие пакеты (НПО «Новое дело», Санкт­ Петербург). Идентификацию бактерий осуществляли на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств.

Последние изучали с использованием коммерческих тест систем ANAERO-TEST 23 (Lachema, Чехия). Гидрофобность бифидобактерий оценивали по Rosenberg et al. с модификациями L-Q Wang et all. [5]. Для этого бифидобатерии выращивали 24 часа на жидкой среде Блаурокк, а затем центрифугировали при 8 000 g в течение 10 мин.

Бактериальную массу дважды отмывали фосфатным буфером и ресуспендировали в том же растворе. Определяли оптическую плотность (А) раствора при длине волны 600 нм. Затем к 3 мл бактериальной суспензии добавляли 1 мл додекана. Фазы перемешивали на Vortex в течение 2 минут и оставляли на 1 час при температуре 37оС для их разделения. Определяли оптическую плотность (А) водной фазы при 600 nm. Аффинитет к углеводородам рассчитывали как процент гидрофобности (Н%) по формуле Н%=[(А0-А)/А0)]Х 100, где А0 и А – оптическая плотность до и после обработки бактериальной суспензии додеканом. Штаммы считали

Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6

высокогидрофобными при Н=60% и, среднегидрофобными при Н=40-59%, низкогидрофобными при Н39%.

Жирнокислотный состав бактериальных липидов определяли с помощью газожидкостной хроматографии. Липидная фракция выделена из отмытой изотоническим раствором NaCI бульонной культуры бифидобактерий экстракцией смесью хлороформ : н-гексан (1:1). Полученный экстракт подвергали метилированию. Образец объёмом 1 мл помещали в виалу объемом 1.5 мл, растворитель отдували азотом досуха. К сухому остатку добавляли 500 мкл 3% раствора Н2SO4 в MeOH. К полученому раствору добавляли внутернний стандарт (10 мкг ундеценовой кислоты). Затем образец нагревали при 90оС в течение часа. Далее проводили экстракцию 700 мкл гексана. Объем отобранной гексановой фракции концентрировали отдувкой растворителя до объема 200 мкл. Полученную пробу, содержащие жирные кислоты в виде метиловых эфиров использовали для анализа.

Метилированные пробы анализировали на хроматомасс-спектрометре Agilent 7000B.

Объем пробы 2 мкл, ввод без деления потока. Колонка: ZB-WAX, 30м*0.25мм*0.25мкм, Условия хроматографирования: Oven Program 50 °C for 0 min then 8 °C/мин to 260 °C-5мин, Flow-1мл/мин.

Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1 лицензионное соглашение ВХХR 006ВО92218 FAN 11).

Обсуждение результатов

Установлено, что масса жирных кислот на 0,01 г сухого остатка у штаммов с высокой и средней гидрофобностью статистически не отличалась друг от друга и составляла 30.4 и 33.6 мкг соответственно (p=0.2). У бифидобактерий с низкой гидрофобностью масса жирных кислот была снижена до 14,5 мг (p=0.03).

Не зависимо от гидрофобности в составе клеточной стенки бифидобактерий преобладали насыщенные жирные кислоты. У высоко и низкогидрофобных штаммов на долю насыщенных жирных кислот приходилось 64.2% и 713% соответственно, тогда как при средней гидрофобности доля этих кислот была наибольшей и составляла 91.1%.

Среди насыщенных жирных кислот у бифидобактерий были обнаружены следующие: лауриновая (С12:0), миристиновая (С14:0), пентадекановая (С15:0), пальмитиновая (С16:0), гептадекановая (С17:0), стеариновая (С18:0), арахиновая (эйкозановая) (С20:0) кислоты. Также среди них присутствовали метилированные кислоты или кислоты с разветвленной цепочкой - 12-метил-тетрадекановая (12Ме­ С14:0), 13-метил-тетрадекановая (13Ме-С14:0), изопентадекановая (isoС15:0), изопальмитиновая (isoС16:0). Разветвленные или алициклические жирные кислоты, благодаря особенностям химического строения у грамположительных бактерий выполняют адаптивную функцию, придавая текучесть и пластичность мембране [6].

Такая же функция присуща и ненасыщенным жирным кислотам, наибольшая доля которых обнаружена у бифидобактерий с высокогидрофобными свойствами (35.8%), несколько меньше у штаммов с низкой гидрофобностью (28.7%). Самое низкое содержание ненасыщенных жирных кислот регистрировали при средней гидрофобности, их доля в общей структуре жирных кислот не превышала 8.9%.

Среди мононенасыщенных жирных кислот у бифидобактерий присутствовали миристоолеиновая (С14:1), пентадеценовая (С15:1), пальмитолеиновая (С16:1), н­ гептадеценовая (С17:1), олеиновая (С18:1). Также были обнаружены

Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6

полиненасыщенные жирные кислоты – гексадекадиеновая (С16:2) и линолеваевая (С18:2).

Количественный состав некоторых жирных кислот бифидофлоры с разной гидрофобностью не отличался друг от друга. Так содержание миристиновой кислоты (С14:0) у высоко и низкогидрофобных штаммов составляло 2.7 и 2.9 мкг соответственно, тогда как при средней гидрофобности не превышало 1.6 мкг, однако, разница была статистически не значима (p=0.1). Также у штаммов с разной гидрофобностью не было статистически значимых отличий по содержанию пентадекановой (С15:0) и гептадекановой кислот (С17:0), количество которых составило у высокогидрофобных культур по 0,7 мкг, у среднегидрофобных по 0.9 и

0.5 мкг и низкогидрофобных 1.1 и 0.4 мкг соответственно (p=0,07).

При анализе количества насыщенных жирных кислот у штаммов с разной гидрофобностью отмечали статистически значимые различия по содержанию изоформ, метилированных и длинноцепочечных жирных кислот, т.е. тех форм, которые определяют жидкокристаллическое состояние мембраны (p=0,00).

Установлено, что изопентадекановая кислота (isoС15:0) присутствовала только у высокогидрофобных бифидобактерий. Также у них в большом количестве регистрировали 13-метил-тетрадекановую кислоту (13Ме-С14:0), ее содержание составило 1.3 мкг (рис. 1). У культур со средней гидрофобностью такую кислоту не детектировали, а при низкой гидрофобности отмечали небольшое ее содержание –

0.1 мкг. У среднегидрофобных бифидобактерий также отсутствовали 12-метил­ тетрадекановая (12Ме-С14:0) и пальмитиновая (С16:0) кислоты, тогда как у высоко и низкогидрофобных штаммов их содержание колебалось в диапазоне 0.3-0.4 мкг и 11,4 –12,5 мкг соответственно. Жидкокристаллическое состояние мембраны у среднегидрофобных бифидобактерий было связано с высоким содержанием изопальмитиновой (isoС16:0) (20.4 мкг) и стеариновой (С18:0) (23.6 мкг) кислот.

Рис. 1. Интегрированная хроматограмма жирных кислот мембраны высокогидрофобного штамма бифидобактерий При высокой и низкой гидрофобности количество изопальмитиновой (isoС16:0) кислоты не превышало 0.3 и 0.4 мкг соответственно, масса стеариновой кислоты (С18:0) составляла 8.0 и 7.2 мкг соответственно.

В составе мембраны среднегидрофобных бифидобактерий отсутствовали такие мононенасыщенные жирные кислоты как миристоолеиновая (С14:1), пентадеценовая (С15:1), пальмитолеиновая (С16:1), н-гептадеценовая (С17:1). Была обнаружена только олеиновая (С18:1) кислота в количестве 1.4 мкг (рис. 2).

Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6 Рис. 2. Интегрированная хроматограмма жирных кислот мембраны среднегидрофобного штамма бифидобактерий При высокой гидрофобности мембраны регистрировали все вышеуказанные ненасыщенные жирные кислоты (рис. 1). Самое большое количество приходилось на пальмитолеиновую (С16:1) кислоту, ее масса составила 4.6 мкг. Данная кислота в наибольшем количестве из ненасыщенных присутствует в составе мембран бактерий многих таксономических групп, т.е. полученные данные согласуются с данными литературы [6]. Также довольно часто у микроорганизмов обнаруживают олеиновую (С18:1) кислоту, содержание которой у высокогидрофобных бифидобактерий составило 3.8 мкг. Несколько меньше в составе мембраны содержалось миристоолеиновой (С14:1) (2.7 мкг) и гептадеценовой (С17:1) (0.5 мкг) кислот.

Пентадеценовая кислота (С15:1) у высокогидрофобных штаммов регистрировалась в количестве не более 0,1 мкг.

Установлено, что у бифидобактерий с низкой гидрофобностью содержание всех жирных кислот было снижено по сравнению с высокогидрофобными культурами (рис.3).

–  –  –

При этом из мононенасыщенных кислот также в наибольшем количестве содержалась пальмитолеиновая (С16:1) (3,7 мкг) и олеиновая (С18:1) (3.2 мкг) кислоты. Миристоолеиновая (С14:1) кислота содержалась в количестве 0.6 мкг.

Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6 Наименьшей была масса пентадеценовой (С15:1) и гептадеценовой (С17:1) кислот, она составила по 0.4 мкг.

Полиненасыщенная линолевая (С18:2) кислота присутствовала в составе липидов всех изученных штаммов бифидобактерий. Максимальное ее количество регистрировалось при высокой гидрофобности и составляло 3.6 мкг, в 2 раза меньше ее содержалось у среднегидрофобных культур бифидобактерий (1,8 мкг), меньше всего данной кислоты было обнаружено у низкогидрофобных штаммов (1,3 мкг).

Заключение

Большое разнообразие и в тоже время специфичность жирных кислот микроорганизмов обусловливают возможность родовой и даже видовой идентификации бактерий [6].

Однако, являясь основным компонентом фосфолипидов, жирные кислоты определяют также физико-химические свойства микроорганизмов, такие как текучесть, устойчивость к температурам, гидрофобность. Установлено, что в целом масса жирных кислот при высокой и средней гидрофобности не отличалась друг от друга, тогда как у низкогидрофобных штаммов была снижена в 2 раза (p=0.03). Как и у большинства микроорганизмов у бифидобактерий содержались как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты с длиной цепи от 14 до 20 атомов углерода. Присутствие ненасыщенных и разветвленных жирных кислот увеличивает текучесть мембраны микроорганизмов [5, 6]. При этом синтез ненасыщенных и метилразветвленных жирных кислот регулируется внешними для микроорганизмов факторами, например, температурой, органическими липофильными соединениями микробного происхождения, наличием разветвленных короткоцепочечных карбоновых кислот, т.е., в целом, состоянием кишечного микросимбиоценоза [5].

У высокогидрофобных бифидобактерий отмечали высокое содержание и разнообразие ненасыщенных жирных кислот с одной или двумя двойными связями.

Также при высокой гидрофобности у бифидобактерий обнаружены разветвленные жирные кислоты - изопентадекановая кислота (isoС15:0) и 13-метил-тетрадекановая кислота (13Ме-С14:0). У штаммов со средней гидрофобностью из ненасыщенных присутствовала только олеиновая (С18:1) и линолевая (С18:2) кислоты в небольших количествах. Гидрофобность среднего уровня у штаммов была связана с изопальмитиновой (isoС16:0) кислотой, содержание которой было в 20 раз больше, чем у штаммов с высокой гидрофобностью. При низкой гидрофобности жидкокристаллическое состояние мембраны определяли ненасыщенные жирные кислоты, содержание которых было снижено, по сравнению с высокогидрофобными культурами. При этом отмечали сходство состава ненасыщенных жирных кислот при низкой и высокой гидрофобности. Однако у штаммов с низкой гидрофобностью в клеточной стенке отсутствовали метилразветвленные жирные кислоты.

Таким образом, механизмы изменения гидрофобности, которая играет основную роль в неспецифической адгезии бактерий, определяются регуляцией содержания ненасыщенных и разветвленных жирных кислот в составе клеточной стенки микроорганизмов.

Захарова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2015. Т. 15. Вып. 6

–  –  –

1. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хлопко 5. Wang L-Q., Meng X-Ch., Zhang B-R. // Ю.А. // Журнал микробиологии, эпидемио­ Word Journal of Microbiology and логии и иммунобиологии. 2009. № 4. С. 4-8. Biotechnology. 2010. Vol. 26. pp. 1999-2007.

2. Захарова Ю.В. // Медицина в Кузбассе. 6. Будников Г.К. Химический анализ в 2010. № 1. С. 14-16. медицинской диагностике. М.: Наука, 2010,

3. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова 504 с.

Е.В. // Журнал микробиологии, эпидемио­ 7. Schneiter R., Toulmay A. // Appl.

логии и иммунобиологии. 2012. № 4. С. 51-56. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol. 73. pp. 1224­

4. Ukuku D.,Yuk H-G., Zhang H. // 1232.

Foodborne Pathogens and Disease. 2011. Vol.

8 (10). pp. 1103-1109.

–  –  –

Захарова Юлия Викторовна – доцент Zakharova Yulia V. – Ph.D. (medical) associate кафедры микробиологии иммунологии и senior lecturer chair of microbiology immunology вирусологии, к.м.н., ГБОУ ВПО «Кемеровская and virology Kemerovo State medical academy, государственная медицинская академия» Kemerovo Минздрава РФ, Кемерово Сухих Андрей Сергеевич – ст. науч. сотр. Sukhikh Andrey S. – Ph.D. (pharm.), senior ЦНИЛ к.фарм.н., доцент, ГБОУ ВПО scientific worker of CSRL Kemerovo State «Кемеровская государственная медицинская medical academy, Kemerovo.

e-mail:

академия» Минздрава РФ, Кемерово. 8(3842) Suhih_as@list.ru 52-10-18

Похожие работы:

«Российская Федерация Администрация Сальского района Ростовской области ПОСТАНОВЛЕНИЕ от 29.12.2014г № 2435 г. Сальск Об установлении цен на платные медицинские, стоматологические услуги, предоставляемые МБУЗ "ЦРБ" Сальского района Во исполнение решения Собра...»

«Правила и сроки госпитализации Условия предоставления медицинской помощи по экстренным показаниям Госпитализация в стационар по экстренным показаниям осуществляется: врачами первичного звена;врачами скорой медицинской помощи;переводом из другой медицинской организации;самостоятельно обративш...»

«Рабочая программа по предмету "Технология. Обслуживающий труд" 5-8 классы Планируемые результаты изучения предмета Выпускник научится: называть и характеризовать актуальные управл...»

«mini-doctor.com Инструкция Делагил таблетки по 250 мг №30 (10х3) ВНИМАНИЕ! Вся информация взята из открытых источников и предоставляется исключительно в ознакомительных целях. Делагил таблетки по 250 мг №30 (10х3) Действующее вещес...»

«Фатеев Дмитрий Николаевич НАСТОЯЩИЙ В ПОЛЕ ЦАРЬ НАШ ИЛЮША ЦЫМБАЛАРЬ! (ОСОБЕННОСТИ КРИЧАЛОК, ПОСВЯЩЕННЫХ ЗВЕЗДЕ РОССИЙСКОГО ФУТБОЛА 90-Х ГГ.) Статья рассказывает о фольклорном жанре футбольная кричалка, актуальном на сегодняшний день. Основн...»

«ВИРУС Алмаз Шарман ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА СПИД СИНДРОМ ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА Эпидемиология, молекулярно-клеточные аспекты, принципы диагностики, терапии, профилактики ВИЧ-инфекции и синдрома приобретенного иммунодефицита Академия профилактической медицины NeiroNex, Бетезда, США Шарман А. Синдром приоб...»

«Ещё один день ндрей вышел на школьное футбольное поле. Несколько ребят, оставив сумки на лавке, шумно гоняли ободранный мяч. Мальчик поправил очки, присмотрелся. В толпе футболистов он увидел одноклассников. Крепыш Вовка Заяц враскорячку стоял на воротах, а рыжий Бабаев, расталкивая соперников, неумело вёл мяч. "Лучше бы че...»

«РАТЬЕВ АНДРЕЙ ПЕТРОВИЧ ЛЕЧЕНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ОБЛАСТИ ЛОКТЕВОГО СУСТАВА 14.01.15 – Травматология и ортопедия Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научный консультант: д.м.н., профессор А.В. Скороглядов г. Москва 2015 г....»

«Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ставропольский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра физики, математики и биотехнологии РАБОЧАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ "ОСНОВЫ БИОЭТИКИ" Направл...»








 
2017 www.kniga.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - онлайн материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.